Riassunti fondamenti di biologia molecolare

idrofile = formano legami a idrogeno con l'acqua
idrofobe = sono molecole apolari che formano strutture che non si sciolgono in acqua e tendono a raggrupparsi tra loro in strutture insolubili in acqua.

Le molecole idrofobe sono insolubili non a causa di legami fra le molecole idrofobe, ma al fatto che le molecole d'acqua, unite mediante legami idrogeno, tendono ad escluderle ad a farle raggruppare tra loro.
Le molecole anfipatiche sono composti organici che presentano una testa polare idrosolubile (a base di fosfato) e una coda non idrosolubile.
Le molecole anfipatiche, immerse in un liquido acquoso, tendono a formare spontaneamente un doppio strato, nel quale le teste idrofile sono rivolte verso l'esterno e le code idrofobe verso l'interno.
Le membrane fosfolipidiche respingono spontaneamente le grandi molecole idrofiliche, mentre le piccole molecole possono diffondere liberamente all'interno della membrana.

Tipi di macromolecole biologiche: zuccheri, lipidi, proteine e acidi nucleici

Molte macromolecole, come proteine e acidi nucleici, sono polimeri.
I polimeri sono costituiti da unità più piccole, i monomeri.
I monomeri si assemblano grazie a reazioni di condensazione e si separano con reazioni di idrolisi.
La forma dei polimeri è correlata alla loro funzione.

Entro certi limiti le molecole possono cambiare configurazione, tuttavia le proprietà biochimiche e le funzioni biologiche di ogni molecola dipendono dalla sua forma geometrica, che a sua volta, è dettata dagli elementi che la compongono.

La forma geometrica di una molecola fa sì che all'interno di essa la distanza fra gli atomi sia ottimale per controbilanciare la repulsione dei doppietti elettronici.

Inoltre, la forma geometrica di una molecola è governata da fattori energetici: essa assume la forma che presenta la più bassa energia potenziale.

Zuccheri o carboidrati

I carboidrati sono costituiti da C, H e O presenti in un rapporto di circa (CH2O)n.
In base al numero di unità di zucchero che contengono i carboidrati si possono dividere in:

monosaccaridi = con una sola unità di zucchero
disaccaridi = con 2 unità di zucchero
polisaccaridi = con molte unità di zucchero

Monosaccaridi

I monosaccaridi sono gli zuccheri più semplici, essi contengono da 3 a 7 atomi di carbonio.
Sono anche noti come zuccheri triosi (3 atomi di C), pentosi (5 atomi di C), esosi (6 atomi di C) ed eptosi (7 atomi di C).

Essi esistono in soluzione esistono come anelli. In particolare il glucosio può formare due anelli che differiscono per l'orientamento del gruppo ossidrilico e che vengono chiamati isomeri.

Amido = è composto da molecole di α glucosio unite mediante legame glicosidico.
Cellulosa = è composta da molecole di β glucosio unite mediante legame glicosidico

Disaccaridi

I disaccaridi sono composti di due monosaccaridi ad anello legati mediante un legame glicosidico, che consiste in un ossigeno centrale legato covalentemente a due atomi di carbonio, uno per anello

Polisaccaridi

I polisaccaridi sono polimeri costituiti da un numero elevato di monosaccaridi uniti da legami glicosidici. Essi comprendono amido, glucosio e cellulosa.
Essi si dividono in:

omopolisaccaridi = sono polisaccaridi composti da un solo tipo di monosaccaride
eteropolisaccaridi = sono polisaccaridi composti da più tipi di monosaccaride

Glicosamminoglicani

I glicosamminoglicani (o GAG o mucopolisaccaridi) sono polisaccaridi che possono legarsi a proteine, formando così i proteoglicani che costituiscono un'importante parte della matrice extracellulare dei tessuti connettivi.
La matrice extracellulare (ECM) è costituita da acqua, proteine e polisaccaridi. Il collagene è la proteina strutturale più abbondante presente nella ECM.

Lipidi

I lipidi sono molecole insolubili in acqua composte da C e H, sono i costituenti delle membrane cellulari e hanno funzioni isolanti, di regolazione o di riserva. Sono lipidi:

trigliceridi (triacilgliceroli) = costituenti del tessuto adiposo
fosfolipidi e glicolipidi = costituenti delle membrane cellulari
colesterolo (steroide) = presente nelle membrane cellulari

Essi sono classificati in:

lipidi neutri (trigliceridi e colesterolo)
lipidi polari (fosfolipidi e glicolipidi)

Acidi grassi

Gli acidi grassi sono acidi carbossilici a lunga catena, essi possono essere:

saturi = privi di doppi legami nella catena carboniosa
insaturi = con uno o più doppi legami (fino a 6)

Trigliceridi

I trigliceridi sono grassi composti da acidi grassi e glicerolo, se a temperatura ambiente sono solidi vengono detti grassi, se sono liquidi vengono detti oli.
Gli oli sono allo stato liquido a temperatura ambiente perché sono ricchi di acidi grassi insaturi.
I trigliceridi del tessuto adiposo hanno funzioni di:

riserva energetica
isolamento termico
protezione degli organi

Fosfolipidi

I fosfolipidi sono costituiti da una molecola di glicerolo attaccata, da un lato a due acidi grassi e dall'altro ad un gruppo fosfato legato ad un composto organico come la colina.
Essi hanno un'estremità idrofila e due lunghe code idrofobiche, formano un doppio strato che costituisce le membrane cellulari.

Colesterolo

Il colesterolo è un componente essenziale della membrana cellulare di tutte le cellule animali. Esso si inserisce tra i due strati fosfolipidici di membrana diminuendo la fluidità della membrana.
È necessario per la sintesi di ormoni steroidei

Proteine

Le proteine sono polimeri lineari formati dall'unione di 20 diversi amminoacidi.
Gli amminoacidi si associano in numero, rapporto e sequenze diversi, generando diverse proteine.

Gli amminoacidi vengono classificati in base al tipo di catena laterale (apolari, polari non dissociabili, acide o basiche).
Le proteine hanno quattro livelli di organizzazione:

struttura primaria
struttura secondaria
struttura terziaria
struttura quaternaria

Struttura primaria

La struttura primaria è la sequenza con cui gli amminoacidi sono legati nella catena polipeptidici.
Lo scheletro delle catene polipeptidiche è costituito dal ripetersi di sequenze: −N−Cα−C−-

Struttura secondaria

La struttura secondaria deriva dai legami a H tra gli amminoacidi della catena polipeptidica. Esistono due tipi di strutture secondarie:

α−elica = gli elementi si avvolgono attorno ad un asse formando un'elica destrorsa, essa conferisce elasticità alle proteine
foglietto β−ripiegato = la catena polipeptidica si ripiega su se stessa con un andamento a zig-zag, due o più catene si affiancano. Esso può essere parallelo o anti-parallelo Conferisce flessibilità alle proteine.

Struttura terziaria

La struttura terziaria di una proteine è la sua conformazione nello spazio tridimensionale, essa è dovuta al ripiegamento su se stessa della sequenza amminoacidica.
Le interazioni possibili sono:

legami a idrogeno
legami ionici/ponti salini con catena laterale
interazioni idrofobiche tra amminoacidi apolari
ponti disolfuro tra residui di catena

Le interazioni degli amminoacidi idrofilici con l'acqua sono importanti per la stabilizzazione della struttura delle proteine.

Struttura quaternaria

Molte proteine sono monomeriche, cioè formate da una sola catena polipeptidica, altre invece sono formate da due o più catene.
L'aggregazione delle catene polipeptidiche dà origine alla struttura quaternaria, che ne determina anche le caratteristiche funzionali.
La stabilità delle strutture quaternarie dipende da legami a idrogeno e ionici, sono assenti i legami covalenti.

Proteine semplici e proteine coniugate

Le proteine semplici sono solo i polipeptidi.
Le proteine coniugate sono polipeptidi + ioni e/o molecole organiche non amminoacidiche (gruppi prostetici).

Acidi nucleici e nucleotidi

Acidi nucleici

Gli acidi nucleici trasmettono l'informazione ereditaria e determinano quali proteine debbano essere sintetizzate dalle cellule.
Nelle cellule ci sono due tipi di acidi nucleici: il DNA (acido deossiribonucleico) e l'RNA (acido ribonucleico).
Il DNA costituisce i geni e contiene l'informazione per sintetizzare tutte le proteine.
L'RNA interviene nel processo in cui gli amminoacidi sono legati fra loro per formare le proteine (traduzione).
Gli acidi nucleici sono polimeri formati da nucleotidi.
I nucleotidi sono formati da:

uno zucchero pentosio (ribosio o desossiribosio)
uno o più gruppi fosfato
una base azotata (purina o pirimidina)

I nucleotidi si legano mediante legami fosfodiesterei a formare le catene polinucleotidiche (gruppo fosfato legato covalentemente allo zucchero adiacente). I legami fosfodiesterei sono legami in cui un gruppo fosfato è legato covalentemente allo zucchero adiacente.

I nucleosidi sono polimeri formati da una base azotata e uno zucchero.

RNA e DNA

L'RNA è un polimero formato da un singolo filamento polinucleotidico
Il DNA è un polimero formato da due filamenti polinucleotidici antiparalleli

Nel DNA i due filamenti polinucleotidici si appaiano attraverso le basi e sono avvolti attorno ad un asse a forma una doppia elica.
L'appaiamento delle basi avviene in modo altamente specifico ed una base purinica è sempre appaiata con una base pirimidinica: adenina con timina e guanina con citosina.
I filamenti appaiati sono antiparalleli e sono uniti mediante legami a idrogeno.

Il DNA nelle cellule svolge una duplice funzione:

trasmette l'informazione genetica da una generazione alla successiva, costruendo copie identiche di se stesso mediante il processo di replicazione. Durante la replicazione, ogni filamento funge da stampo per la sintesi di un filamento complementare, generando due molecole figlie uguali alla molecola madre.
funziona da stampo per la sintesi di RNA (trascrizione) che, in molti casi, dirige la sintesi delle proteine (traduzione): DNA→RNA→proteina

Tipologie di RNA

Ci sono tre tipologie di RNA:

RNA messaggero = trasporta le sequenze di DNA ai ribosomi
RNA transfer = provvede a fare da tramite tra l'mRNA e gli amminoacidi, trasferisce gli amminoacidi ai ribosomi
RNA ribosomiale = componente strutturale dei ribosomi

Ci sono anche altri tipi di RNA che hanno funzioni regolatorie

Nucleotidi con funzione energetica

L'Adenina e la guanina svolgono un ruolo importante nei trasferimenti di energia. L'adenosina trifosfato (ATP), costituita da adenina, ribosio e tre fosfati è la più importante molecola energetica cellulare.
La scissione dei legami fosfoanidrici dell'ATP genera una grande quantità di energia.
La guanosina trifosfato (GTP) è un'altra molecola energetica che ha anche un ruolo importante nella segnalazione cellulare.

Cellula

Tutte le cellule hanno almeno tre aspetti strutturali in comune:

la membrana plasmatica
il citoplasma
il nucleo o nucleoide

La membrana plasmatica circonda la cellula, ne definisce i confini e ne racchiude il contenuto, separandola dall'ambiente esterno.
Essa permette lo scambio dall'interno verso l'esterno e permette alle cellule di interagire con l'ambiente circostante.

Il citoplasma è una matrice semifluida all'interno delle cellule.

Il nucleo è la regione cellulare in cui si trova il DNA.

Esistono due tipi di cellule:

procarioti = sono gli organismi unicellulari
eucarioti = sono gli organismi pluricellulari

Cellula procariota

La cellula procariota non possiede nucleo, è unicellulare

Essa è estremamente semplice:

all'esterno, a ridosso della membrana plasmatica o plasmalemma, si trova quasi sempre una parete
all'esterno della parete può essere presente un rivestimento esterno spesso chiamato capsula
dalla cellula possono sporgere strutture quali flagelli (fibre usate come propulsori per lo spostamento) e pili
all'interno del plasmalemma è localizzato il citoplasma, in cui si trovano il nucleoide, ribosomi, enzimi, sostanze di riserve e diverse molecole

Il nucleoide

Il cromosoma batterico o nucleoide è costituito da un'unica molecola di DNA a forma circolare.
Esso però è sprovvisto di nucleoli e membrana nucleare che lo separa dal citoplasma.

Caratteristiche dei procarioti

Caratteri condivisi da tutti i procarioti

membrana plasmatica
nucleoide
citoplasma

Strutture specializzate presenti in alcune cellule procariotiche

capsula = i batteri devono inserire continuamente proteine di varia composizione nelle loro membrane per sfuggire alla risposta immunitaria (funzione di protezione); la capsula inoltre ne impedisce la disidratazione
i batteri possono muoversi grazie ai flagelli o pili, appendici filamentose
parete cellulare = conferisce supporto meccanico e mantiene la forma, in base alla costituzione della parete si distinguono batteri GRAM-positivi o GRAM-negativi (che vengono colorati o meno dal colorante Gram)
membrane fotosintetiche = i cianobatteri non hanno cloroplasti ma membrane all'interno delle quali si svolge la fotosintesi

La cellula eucariota

Nella cellula eucariota sono presenti compartimenti interni delimitati da membrane chiamate organelli o organuli.

La densità delle macromolecole nelle cellule è molto alta.

Il citoplasma

Il citoplasma è costituito da una matrice acquosa colloidale chiamata citosol.
Il citosol contiene: acqua, zuccheri, lipidi, amminoacidi, proteine e ribosomi.
La componente solida è costituita dagli organelli citoplasmatici.
La maggior parte delle attività molecolare si svolgono nel citoplasma.

Il nucleo

L'involucro nucleare è costituito da una doppia membrana che separa il nucleo dal citoplasma. Questa membrana è continua con un organulo citoplasmatico denominato reticolo endoplasmatico.
L'involucro è perforato da numerosissimi pori nucleari, costituiti da complessi proteici che regolano il passaggio di materiali tra nucleoplasma e citoplasma.
Le dimensioni dei pori impediscono al DNA di uscire ma consentono il passaggio di altre molecole tra cui l'RNA.
Al di sotto della membrana nucleare vi è la lamina nucleare, una rete fibrosa costituita da filamenti che sostiene e dà forma al nucleo.

La laminare nucleare è formata di diverse proteine, come la lamina A/C e la lamina B1 che costituiscono reti filamentose ma interconnesse che danno sostegno e forma al nucleo nelle cellule eucariotiche.
Esse partecipano anche ad altre funzioni complesse quali l'organizzazione della cromatina e la regolazione dell'espressione genica.

Nucleoplasma

Il nucleoplasma ha una composizione simile a quella del citosol: acqua, ioni e molecole chimiche più o meno complesse.
Nel nucleoplasma si trova la cromatina che è un complesso di DNA e proteine (istoni).
La cromatina non è disorganizzata: le molecole di DNA sono estremamente lunghe e devono essere impacchettate in strutture regolari dette cromosomi.

Nell'uomo i 46 cromosomi metafasici diventano visibili in forma di strutture filiformi durante la divisione cellulare.

I nucleoli

La maggior parte dei nuclei contiene una o più strutture compatte dette nucleoli. Essi non sono circondati da membrane.
Ciascun nucleolo contiene regioni cromosomiche che contengono le informazioni per sintetizzare i diversi tipi di RNA ribosomiali (rRNA),
Gli rRNA sono sintetizzati nel nucleolo.
Gli rRNA insieme alle proteine ribosomiali formano i ribosomi.
Le proteine ribosomiali invece vengono sintetizzate nel citoplasma e vengono poi importate nel nucleolo.
RNA e proteine ribosomiali vengono assemblate in subunità dette ribosomi, che vengono esportate dal nucleo attraverso i pori nucleari.

Reticolo endoplasmatico

Il reticolo endoplasmatico (RE) è un labirinto di membrane.
Esso appare come una rete di sacchi appiattiti (cisterne), tubuli e canali connessi ed intercomunicanti tra loro.
Lo spazio interno è detto lume del reticolo.
Ci sono due tipi di reticolo endoplasmatico:

rugoso (RER = con ribosomi adesi
liscio (REL) = privo di ribosomi

Il RE comprende anche un sistema di tubuli del RE periferico che si estende dalla periferia della cellula

Reticolo endoplasmatico rugoso (RER)

La faccia luminale del RER è nuda, mentre la faccia citoplasmatica del RER è rivestita da ribosomi, che gli conferiscono un aspetto ruvido o rugoso.

I ribosomi sintetizzano proteine che:

in piccola parte saranno trasportate e rilasciate all'interno della cellula
in gran parte rimarranno nel RE o saranno incorporate in organelli come il Golgi, i lisosomi la membrana plasmatica o vescicole di secrezione

Il RER è anche la sede delle tappe iniziali della sintesi delle glicoproteine.
Il processo di glicosilazione (modificazione post-traduzione mediante aggiunta di una unità di zucchero) sarà poi terminato in un altro organello detto apparato di Golgi.
Il RER contiene chaperon molecolari, ovvero delle proteine, che assistono il corretto ripiegamento delle proteine di nuova sintesi e l'assemblaggio di proteine multimeriche.

Il RER appare come un organello composto da cisterne ed è continuo con la membrana esterna dell'involucro nucleare, la quale presenta anch'essa ribosomi sul versante citosolico.
Esso è il punto di partenza della via biosintetica ed è il punto di sintesi delle proteine, dei carboidrati e dei fosfolipidi che viaggiano attraverso i compartimenti membranosi della cellula.

Reticolo endoplasmatico liscio (REL)

Il REL è in continuità con il RER ed è costituito prevalentemente da da strutture tubulari. Esso è la sede di diversi processi, tra cui:

sintesi dei lipidi = acidi grassi, fosfolipidi, colesterolo ed ormoni steroidei. È la sorgente primaria dei lipidi di membrana
metabolismo dei carboidrati
detossificazione = di farmaci e sostanze tossiche, nelle membrane del REL si trovano enzimi che incrementano la solubilità in acqua di composti tossici, favorendone l'escrezione con le urine
immagazzinamento del calcio = necessario, nelle cellule muscolari, per rispondere a segnali e contrazione

I ribosomi

I ribosomi sono complessi di forma tondeggiante costituiti da rRNA d proteine ribosomiali.
Si trovano o liberi nel citoplasma o adesi al reticolo endoplasmatico ruvido (RER).
Essi sono costituiti da due subunità (maggiore e minore) con specifici coefficienti di sedimentazione. Quando le due subunità si assemblano sono responsabili dell'assemblaggio dei polipeptidi (sintesi proteica).
Ci sono due tipologie di ribosomi:

ribosomi attaccati al RER = che sono legati al RER
liberi = che sono all'interno del citoplasma

Le proteine possono essere sintetizzate in questi due luoghi, nello specifico:

nei ribosomi attaccati al RER = sono proteine secrete dalla cellula, proteine integrali di membrana e proteine solubili che risiedono all'interno dei compartimenti del sistema delle endomembrane
nei ribosomi liberi = i polipeptidi sintetizzati qui vengono successivamente rilasciati nel citosol. Sono proteine citosoliche (enzima e proteine del citoscheletro), proteine periferiche della superficie interna delle membrane e proteine che sono trasportate nel nucleo. Poi ci sono altre proteine che devono essere incorporate in perossisomi e mitocondri.

Ipotesi di Blobel

Essa dice che:

le proteine di secrezione contengono una sequenza segnale alla loro estremità N-terminale che dirige il polipeptide alla membrana del RE. La sequenza segnale è riconosciuta dalla signal recognition particle (SRP), un'abbondante proteina citosolica
il polipeptide entra nelle cisterne del RE attraverso un canale proteico man mano che viene sintetizzato (co-traduzionalmente)

Sintesi delle proteine secretorie e lisosomiali sui ribosomi legati a membrane

La sintesi del polipeptide inizia dopo che un RNA messaggero si lega ad un ribosoma libero, cioè che non è legato ad una membrana citoplasmatica.
Si pensa che tutti i ribosomi siano identici, quelli che sintetizzano proteine di secrezione e lisosomiali provengono dalla stessa popolazione (pool) di quelli utilizzati per la produzione di proteine che rimangono nel citosol.
I polipeptidi che devono essere assemblati sui ribosomi legati alle membrane contengo una sequenza segnale, che include una successione di 6-15 residui amminoacidici idrofobici, che indirizza il polipeptide nascente alle membrane del RE.
Benché la sequenza segnale sia generalmente localizzate all'N-terminale o vicina ad esso, essa può occupare una posizione interna in alcuni polipeptidi.
Quando la sequenza segnale emerge dal ribosoma, viene riconosciuta da una particella di riconoscimento del segnale (SRP).
La SRP si lega alla sequenza segnale e blocca temporaneamente la traduzione e quindi l'allungamento del polipeptide nascente (stadio 1).

Il complesso SRP-ribosoma-polipeptide nascente prende contatto con la membrana del RE.
La SRP si lega al recettore per l'SRP (stadio 2). Sia SRP che recettore per l'SRP sono proteine che legano il GTP. La loro interazione provoca l'idrolisi del GTP legato e il rilascio del SRP dal suo recettore e dalla sequenza segnale (stadio 3).
Il ribosoma si attacca con il traslocone (stadio 3), con un canale di membrana del RE.
Il contatto della sequenza segnale con l'interno del trasloclone porta allo spostamento dell'α\alphaα-elica che occlude il canale (stadio 3).
Il polipeptide nascente è poi traslocato attraverso l'anello del poro idrofobico e nel lume del RE (stadio 4).
Una volta che la traduzione è terminata e il polipeptide completo è passato attraverso il traslocone, il ribosoma è rilasciato e il canale viene prontamente sigillato per mantenere inalterati i gradienti ionici tra il lume del RE e il citosol.
Il peptide nascente rilasciato interagisce con chaperon molecolare quali Bip (stadio 4).
Per ricavare energia per tutte queste fasi si va ad idrolizzare il GTP.
Peptidasi del segnale = enzima che rimuove la sequenza segnale dalla proteina.

Processamento delle proteine nel RE

Appena un polipeptide nascente entra nelle cisterne del RER, interagisce con numerosi enzimi:

la sequenza segnale viene rimossa dalla maggior parte dei polipeptidi, ad opera della peptidasi del segnale
i carboidrati vengono aggiunti alla proteina nascente per mezzo dell'oligosaccariltrasferasi
il lume del RER contiene chaperoni che riconoscono e legano proteine non ripiegate o ripiegate male e danno loro l'opportunità di assumere la corretta struttura tridimensionale
i legami disolfuro tra residui di cisteine sono catalizzati dalla proteina disolfuro isomerasi (PDI) che si trova nel lume del RER.

Orientamenti delle proteine di membrana

Le proteine integrali di membrana attraversano la membrana attraverso regioni α-eliche da 20 a 25
aminoacidi idrofobici, che possono essere inseriti in una varietà di orientamenti. Le proteine attraversano ciascuna la membrana una volta, ma differiscono nel fatto che, in una la proteina inizia con un un amino (N) mentre l'altra con un carbossi (C). Tutto ciò avviene sempre sul lato citosolico.

Sintesi delle proteine integrali di membrana sui ribosomi legati a membrane

Anche le proteine integrali di membrana (tranne quelle dei mitocondri) vengono sintetizzate sui ribosomi del RER.
Però. diversamente dalle proteine di secrezione, le proteine integrali contengono uno o più segmenti idrofobici transmembrana che ne garantiscono l'inserzione nel doppio stato lipidico.
Il polipeptide nascente viene legato all'SRP e portato al traslocone come visto prima.
Il polipeptide nascente entra nel traslocone e proprio come se fosse una proteina di secrezione (stadio 1).

L'entrata nella sequenza idrofobica transmembrana nel poro del traslocone blocca l'ulteriore traslocazione del polipeptide nascente attraverso il canale.
Il traslocone si apre lateralmente per espellere il segmento di transmembrana nel doppio strato (stadio 2).
In questo caso, la proteina ha l'estremità N-terminale nel lume del RE e l'estremità C-terminale nel citosol (stadio 3).

Nel caso delle proteine con estremità N-terminale nel citosol, si pensa che il traslocone ri-orienta il segmento transmembrana attraverso le interazioni con le cariche opposte, presenti sulla superficie (stadio 2a), in modo che l'estremità più positiva si affacci verso il citosol.
Dopo, il traslocone si apre lateralmente per espellere il segmento transmembrana nel doppio strato (stadio 3a). Il polipeptide nascente continua il suo ingresso nel lume fino ad essere completamente passato stadio 4a.
Nel caso delle proteine che attraversano più volte la membrana, il traslocone ruota ogni segmento transmembrana che incontra di 180° e la disposizione dei segmenti della membrana dipende dalla direzione in cui è inserito il primo segmento.

Glicosilazione delle proteine nel RER

La N-glicosilazione è l'aggiunta di una catena glucidica a livello dell'atomo di azoto di una catena laterale di una proteina.
Quasi tutte le proteine del RER diventano glicoproteine. I gruppi oligosaccaridici hanno un ruolo chiave nella funzionalità delle glicoproteine, in particolare come siti di legame nella loro interazione con altre molecole.
L'aggiunta di zuccheri ad una catena oligosaccaridica è catalizzata da un gruppo di enzimi legati alla membrana chiamati glicosiltrasferasi. Nel RER avviene solo l'assemblaggio degli oligosaccaridi legati all'asparagina (N-glicosilazione).
Il montaggio della catena di carboidrati avviene su un trasportatore lipidico, chiamato dolicol fosfato (Dol-P-P).
La catena è composta da 2 unità di N-acetilglucosammina, 9 unità di mannosio e 3 unità di glucosio che vengono aggiunte una alla volta da glicosiltrasferasi di membrana.
Questo blocco di 14 zuccheri è poi trasferito, dall'enzima oligosaccariltrasferasi del RE, dal dlicol fosfato al polipeptide nascente.

I primi 7 zuccheri (5 mannosi e 2 residui di N-acetilglucosamina/NAG) sono attaccati al dolicol fosfato (tappe 1 e 2).
L'oligosaccaride si trova nel citosol, mentre la spesa energetica della glicosilazione è a carico del GTP.
Il dolicolo con l'oligosaccaride legato ruota, trasportando l'oligosaccaride nel lume del RE (tappa 3).
Vengono poi aggiunti 4 residui di mannosio e 3 di glucosio.

I 4 residui di mannosio e 3 di glucosio sono aggiunti uno alla volta da molecole di dolicol fosfato (tappe 4-9).
Il dolicol fosfato monoglicosilato nel citosol ruota e trasferisce lo zucchero alla molecola adiacente nel lume.
L'oligosacarride è completamente assemblato (tappa 9).

L'oligosaccaride è trasferito al residuo di asparagina (Asn) della catena polipeptidica nascente (tappa 10).
La molecola di dolicol fosfato ritorna nella membrana del RE (tappa 11).
Ricomincia il ciclo su una nuova molecola.

Controllo qualità

Subito dopo il trasferimento al polipeptide nascente, la catena oligosaccaridica viene modificata nel RE. La glicosidasi I e II rimuovono 2 dei 3 residui terminali di glucosio (stadio 1). Il glucosio residuo si lega ad un chaperone (calnexina o calreticolina).
Il glucosio residuo viene rimosso dalla glucosidasi II e ciò porta al rilascio della glicoproteina (stadio 3).
Se la glicoproteina non ha ancora assunto la sua conformazione nativa, essa viene riconosciuta dall'enzima di monitoraggio, glicosiltrasferasi (GT), che aggiunge nuovamente un residuo di glucosio (stadio 4).
GT riconosce le proteine ripiegate in modo scorretto perché queste mostrano residui idrofobici che sono normalmente assenti in quelle ripiegate correttamente.
Una volta che il residuo di glucosio viene aggiunto, la glicoproteina etichettata viene riconosciuta dagli stessi chaperoni del RE, che le danno un'altra possibilità di ripiegarsi correttamente (stadio 5).
Questo processo viene ripetuto finché la glicoproteina è ripiegata correttamente e prosegue per la sua via (stadio 6: uscita).
Se la glicoproteina non riesce a ripiegarsi correttamente, un residuo di mannosio viene tagliato da un enzima ad azione lenta che agisce sulle proteine che rimangono nel RE per un lungo periodo (stadio 7).
Una volta che uno o più residui di mannosio sono stati rimossi, la proteina non può più essere riciclata. La proteina è retro-traslocata attraverso la membrana del RE per essere degradata dal citoplasma (stadio 8).
Questo processo è noto come degradazione associata al RE (ERAD).

Apparato del Golgi

L'apparato di Golgi è l'organello che permette l'ulteriore maturazione e la destinazione corretta delle molecole prodotte nel reticolo endoplasmatico. Le vescicole provenienti dal RE si fondono alla regione cis dell'apparato di Golgi e fuoriescono dalla regione trans, indirizzate verso la loro destinazione tramite il trasporto con microtubuli.

Esso è costituito da pile di sacchi appiattiti (cisterne), delimitati da membrane ed impilati (pile del Golgi).
Le cisterne rivolte verso il RE sono dette cis, mentre quelle rivolte verso la membrana plasmatica sono dette trans.
Le pile del Golgi sono circondate da vescicole.
Le vescicole provengono dal RE e contengono lipidi e proteine (vescicole di transizione).
Le vescicole che originano direttamente dal Golgi trasferiscono proteine e lipidi ad altre vescicole o ad altre destinazioni nella cellula (vescicole di spola).
All'interno di cisterne cis e trans e zona mediale avvengono specifiche reazioni biochimiche di maturazione di proteine e lipidi, che consentono la sintesi di glicoproteine o glicolipidi, rispettivamente l'assemblaggio finale di carboidrati con proteine o lipidi.
Le altre reazioni di modificazione sono: acetilazione, solfatazione e deamminazione. Oltre queste c'è ne sono molte altre di modificazioni post-traduzionali (ovvero modificazioni apportate alle proteine dopo la loro sintesi o traduzione).

Il Golgi svolge due funzioni principali: modificazione e smistamento.
Le vescicole che originano dal Golgi per gemmazione sono destinate a:

fusione con la membrana plasmatica al fine di secernere il loro contenuto
trasformazione in lisosomi

Vi sono poi vescicole endocitiche che dalla membrana plasmatica si fondono con il Golgi, in questo modo la cellula acquisisce nuove sostanze e ricicla i lipidi e le proteine specifiche delle cisterne.

La glicosilazione nel complesso di Golgi

Il complesso di Golgi svolge un ruolo chiave nell'assemblaggio dei carboidrati che fanno parte delle glicoproteine e dei glicolipidi.
Quando le proteine solubili e le glicoproteine di membrana attraversano le cisterne cis e mediali del Golgi, la maggior parte dei residui di mannosio vengono rimossi ed altri zuccheri vengono aggiunti in sequenza.
La sequenza con cui gli zuccheri sono incorporati è determinata dalla disposizione delle specifiche glicosiltrasferasi che entrano in contatto con la proteina mentre si muove attraverso il Golgi.

O-glicolazione nel Golgi

Diversamente dagli oligosaccaridi legati all'N, la cui sintesi comincia nel RE, quelli fissati dalle proteine da legami con l'ossigeno (di serine o threonine) sono assemblati interamente all'interno del complesso del Golgi.
Il complesso di Golgi è anche il luogo della sintesi della maggior parte dei polisaccaridi complessi della cellula.
In base al tipo di enzima presente, diversi tipi di glicosilazione avvengono nei vari sub-compartimenti del Golgi.

Il movimento di materiali attraverso il Golgi

Ci sono due teorie che esistono per spiegare come il materiale si muove attraverso il complesso di Golgi:

modello della maturazione delle cisterne = le cisterne si formano alla faccia cis per fusione dei trasportatori provenienti dal RE e dall'ERGIC. Ogni cisterna si muove fisicamente dall'estremità cis verso quella trans, cambiando composizione (ogni cisterna matura nella cisterna seguente). Gli enzimi ed altri componenti viaggiano nelle vescicole (ma non cargo)
modello del trasporto vescicolare = le cisterne rimangono sul posto come compartimenti stabili. Il carico viene trasportato dal CGN al TGN, in vescicole che gemmano dalla membrana di un compartimento e si fondono con il compartimento adiacente. In questo caso le cisterne sono fisse, ciò che viaggia nelle vescicole è il cargo da secernere. Esso però è superato

Tipi di rivestimento delle vescicole

Le vescicole possono essere ricoperte da COPI e COPII.
COPI e COPII sono dei complessi proteici.
Le vescicole rivestite da COPI mediano il trasporto retrogrado delle proteine.
L'assemblaggio del rivestimento è simile a quello delle vescicole da COPII, ma le proteine usate sono diverse.
Le vescicole rivestite da COPI sono implicate nel trasporto di:

enzimi del Golgi, in direzione trans e cis
enzimi del RE dall'ERGIC e dal Golgi, indietro verso il RE

Quindi sono implicate nel recupero/riciclaggio di componenti nel RE.

Differenze tra RER e Golgi

Il RER:

è sede della biosintesi delle proteine
è sede di modificazione mediante glicosilazione delle proteine su residui di asparagina (N-glicosilazione)
è sede del ripiegamento corretto delle proteine, assistito da chaperoni residenti nel RE (calreticulina)
è il punto di partenza per il trasporto di proteine verso l'apparato di Golgi

Il Golgi:

modifica le proteine che provengono dal RER attraverso O-glicosilazione ma anche fosforilazione
smista le proteine indirizzandole ad altre vescicole o alla membrana plasmatica, quindi partecipa ai processi di secrezione cellulare
partecipa alla formazione di lisosomi
è sede di sintesi di alcuni lipidi

Il Golgi è polarizzato (faccia cis-mediale-trans): la sua polarizzazione è fondamentale per la corretta maturazione delle proteine.
Una volta formate, le cisterne cis si spostano verso la faccia trans del Golgi e subiscono trasformazioni enzimatiche. Il ritorno degli enzimi dal Golgi trans al Golgi cis ed anche al RER avviene attraverso vescicole di riciclaggio ed è essenziale per permettere alle cisterne di mantenere le caratteristiche enzimatiche necessarie per ogni fase della maturazione.
La glicosilazione delle proteine serve a:

favorire il corretto ripiegamento delle proteine nella conformazione tridimensionale biologicamente attiva
proteggerle dall'azione proteolitica delle proteasi (gli zuccheri formano una barriera)
aumentano la solubilità delle proteine e ne possono facilitare il trasporto

Il citoscheletro

Il citoscheletro è composto da reti di 3 diversi tipi di filamenti:

microtubuli
microfilamenti
filamenti intermedi

Il citoscheletro svolge le seguenti funzioni:

sostiene la cellula e ne mantiene la forma
è alla base del movimento cellulare
provvede a posizionare gli organuli nel citoplasma
mantiene la cellula nella giusta posizione

I microtubuli (25 nm)

I microtubuli sono cilindri cavi formati da 13 protofilamenti disposti ad anello.
Ogni protofilamento è costituito dalla proteina dimerica tubulina: α\alphaα-tubulina e β\betaβ-tubulina che si impilano nella stessa direzione.
I cilindri hanno una polarità: l'estremità più e l'estremità meno.
I microtubuli polimerizzano e depolimerizzano, sono pertanto strutture dinamiche e instabili.
I microtubuli svolgono vari ruoli:

mantengono la forma delle cellula
sono coinvolti nella divisione cellulare (centrioli)
fungono da binari per i movimenti intracellulari
costituiscono l'assonema di ciglia e flagelli, strutture di motilità

Microtubuli e centrioli

L'estremità più è periferica mentre quella meno è centrale ed ancorata ad un centro di nucleazione detto centro di organizzazione dei microtubuli (MTOC) o centrosoma.
Il centrosoma risulta dall'associazione di due cilindretti cavi disposti in maniera perpendicolare detti centrioli.
I centrioli sono strutture costituite da 9 triplette di microtubuli localizzati nel centrosoma.
I MTOC organizzano e polarizzano i microtubuli all'interno della cellula.
Durante la divisione nucleare (mitosi o meiosi), i microtubuli formano il fuso mitotico e mantengono l'organizzazione dei cromosomi.

Microtubuli e trasporto cellulare

Due tipi di proteine sono associate ai microtubuli (MAP):

proteine con funzioni strutturali, che regolano l'assemblaggio dei microtubuli
proteine con funzioni motrici, che usano ATP per generare movimento

Il trasporto avviene in due direzioni opposte ed è regolato da specifiche proteine motrici:

la chinesina è responsabile del movimento verso l'estremità più dei microtubuli (trasporto anterogrado)
la dineina è responsabile del movimento opposto verso l'estremità meno (trasporto retrogrado)

Entrambi i motori molecolari possono essere attaccati sullo stesso cargo.

I microfilamenti (7 nm)

Lunghe fibre di 7 nm costituite da monomeri di F-actina avvolti ad elica, come due fili di perle.
Ciascun filamento di F-actina deriva dalla polimerizzazione di actina monomerica in forma globulare.
Anche i monomeri di actina polimerizzano tutti con lo stesso orientamento, generando filamenti con polarità.
I filamenti di actina non possono contrarsi, ma possono generare movimento attraverso un rapido assemblaggio e disassemblaggio.
I microfilamenti possono organizzarsi in fasci di fibre, detti fibre da stress, che conferiscono un supporto meccanico a diverse strutture cellulari.
Possono anche organizzarsi a generare strutture orientate dette filopodi e lamellipodi. Essi sono dispersi nel citosol, ma con maggior contrazione vicino alla membrana plasmatica, al fine di rafforzarla e mantenerne la forma cellulare.
I lamellipodi partecipano al movimento cellulare.

I filamenti intermedi (8-12 nm)

Si trovano solo nelle cellule degli organismi pluricellulari dove conferiscono sostegno.
Sono molto più stabili di microtubuli e microfilamenti e stabilizzano la forma cellulare.
Sono costituiti da polipeptidi diversi, in base al tipo di cellulare. Tra i principali troviamo:

cheratine = in cellule epiteliali, unghie e capelli
vimentine = nel tessuto connettivo
desmine = nelle cellule muscolari
neurofilamenti = nelle cellule nervose

Tra le funzioni dei filamenti intermedi, troviamo:

forma cellulare
forniscono forza meccanica alla cellula
ancoraggio delle membrane cellulare e nucleare

Vi sono poi le lamine nucleari (lamin A/C e lamine di tipo B), filamenti intermedi presenti al di sotto dell'involucro nucleare, al quale danno forma e sostegno.

Funzioni specializzate del citoscheletro

I filamenti di actina supportano i microvilli, piccole protrusioni della membrana plasmatica che aumentano la superficie cellulare al fine di aumentare l'assunzione di materiale nutritivo.

Ciglia e flagelli

Ciglia e flagelli sono appendici cellulari con funzioni motrici o di trasporto di fluidi.
Un ciglio è costituito da microtubuli in una disposizione 9 coppie + 2 microtubuli centrali circondati dalla membrana plasmatica; la proteina dineina sposta i microtubuli formando e rompendo ponti trasversali su coppie adiacenti di microtubuli.

Tipi di movimento possibili

I tipi di movimento possibili sono:

la proteina motrice si sposta lungo un filamento trasportando un carico
le proteine motrici sono fisse e provocano il movimento di un filamento
le proteine motrici e i filamenti non sono liberi di muoversi, così che l'azione della proteina motrice provoca una flessione

Trasporto bidimensionale delle vescicole e di cargo

Le proteine inserite nella membrana delle vescicole interagiscono con proteine ponte che a loro volta legano le proteine motrici

Le vescicole di trasporto possono anche essere lipidi.
Gli endosomi contengono e accumulano colesterolo per poi ridistribuirlo dalle membrane endosomiali al RE.

Il sistema delle endomembrane

Il reticolo endoplasmatico, il complesso di Golgi, gli endosomi e i lisosomi sono organelli circondati da membrane. Sebbene ciascuno di questi organelli abbia la sua struttura e funzione, il loro insieme costituisce un sistema di endomembrane strutturalmente e funzionalmente interconnesso.

I materiali (proteine e lipidi) sono trasportati da un organello all’altro in piccole vescicole di trasporto rivestite di membrana e che si formano per gemmazione di un compartimento donatore.

Queste vescicole di trasporto si muovono nel citoplasma secondo direzioni precise, spesso spinte da proteine motrici lungo binari formati da microtubuli del citoscheletro.

Due vie di trasporto vescicolare: biosintetica (esocitosi) ed endocitosi

Via biosintetica, in cui le proteine sono:

sintetizzate nel reticolo endoplasmatico;
modificate nel passaggio attraverso il complesso di Golgi;
trasportate da questo alle varie destinazioni quali membrana plasmatica e lisosomi.

Questa via è definita anche come via secretoria, dal momento che molte delle proteine sono destinate ad essere secrete mediante:

secrezione costitutiva: il materiale viene rilasciato in maniera continua.
secrezione regolata: il materiale viene accumulato in vescicole o granuli di secrezione per esser rilasciato soltanto in risposta ad uno stimolo appropriato.

Via endocitica: trasporta materiali dall’esterno della cellula verso compartimenti interni (endosomi e lisosomi).

Il trasporto delle vescicole richiede un definito quadro del traffico per assicurare che i materiali indirizzati a differenti destinazioni siano consegnati correttamente.

Per esempio, proteine che devono essere secrete devono essere indirizzate ai granuli di secrezione mentre enzimi lisosomali devono essere specificamente inviati ai lisosomi.

Inoltre, differenti organelli contengono differenti proteine integrali di membrana, quindi anche loro devono essere indirizzate a particolari organelli.

I cargo (proteine di secrezione, enzimi lisosomali, proteine di membrana) vengono inviati a destinazione cellulari predeterminate attraverso l’uso di segnali di smistamento, codificati nella sequenza amminoacidica della proteina oppure negli oligosaccaridi legati (glicosilazione).

I segnali di smistamento sono riconosciuti da specifici recettori della membrana o del rivestimento superficiale delle vescicole, assicurando che la proteina sia trasportata alla sua giusta destinazione.

Trasferimento di materiale dal compartimento donatore a quello accettore.

Le vescicole si formano per gemmazione dalla membrana.

In questo momento proteine della membrana donatrice vengono incorporate nella membrana della vescicola.

Le proteine solubili del compartimento donatore si legano a specifici recettori.

La vescicola di trasporto si fonde con la membrana del compartimento accettore.

Le proteine di membrana della vescicola sono integrate nel compartimento accettore.

Le proteine solubili vengono rilasciate dal recettore del compartimento donatore al lume della vescicola/compartimento accettore.

Lisosomi

I lisosomi (derivanti dal trans-Golgi) sono piccole vescicole con funzione digestiva che possono contenere fino a 40 enzimi digestivi diversi, detti idrolasi acide.

Le idrolasi acide vengono attivate in ambiente acido, a pH 5. Il pH del citosol è pari a 7.

L’alta concentrazione di idrogenioni (H+) è mantenuta dalla pompa protonica ATP-dipendente, che si trova nella membrana dei lisosomi.

Le idrolasi acide sono: Nucleasi, Proteasi, Glicosidasi, Lipasi, Fosfatasi, Sultafasi, Fosfolipasi

Quindi i lisosomi sono in grado di digerire: proteine, acidi nucleici (RNA e DNA), zuccheri e lipidi.

La membrana dei lisosomi contiene proteine altamente glicosilate che la proteggono dall’azione delle idrolasi acide. Queste proteine di membrana, insieme agli enzimi lisosomiali, sono sintetizzati a livello del RER e trasferiti successivamente al Golgi per maturazione.

Si distinguono i lisosomi primari ed i lisosomi secondari.

Dal Golgi derivano i lisosomi primari, che contengono gli enzimi idrolitici ma hanno pH non acido e sono ancora funzionalmente inattivi.

Il lisosoma si fonde poi con un fagosoma (vescicola di origine intracellulare o extracellulare).

La pompa protonica si attiva, abbassando il pH ed attivando le proprietà digestive delle idrolasi acide. Questo lisosoma a pH acido ed attivo si chiama lisosoma secondario.

Funzioni: digestione di materiale intracellulare o extracellulare.

Lisosomi e funzione immunitaria: i macrofagi ed i neutrofili (cellule specializzate del sistema immunitario) utilizzano i lisosomi per digerire e neutralizzare batteri o residui cellulari.

Autofagia, Lisosomi e fitness delle cellule: mediante il processo di autofagia le cellule degradano componenti cellulari danneggiati o potenzialmente tossici come proteine danneggiate o aggregati proteici o organelli non funzionanti o “vecchi”.

I lisosomi possono anche fondere con la membrana plasmatica e rilasciare i loro enzimi al di fuori della cellula, dando luogo alla digestione extracellulare.

Gli enzimi lisosomali sono sintetizzati nel RER e vengono trasferiti al Golgi dove subiscono un processo di maturazione.

Dal Golgi originano diversi tipi di vescicole.

Se le vescicole gemmano continuamente dai compartimenti membranosi, come fa ogni compartimento a mantenere la propria composizione?

ritenzione
recupero delle proteine del RE

Ritenzione e recupero delle proteine del RE

Le proteine vengono mantenute in un determinato organello tramite 2 meccanismi:

1- La ritenzione: le molecole residenti vengono escluse dalle vescicole di trasporto. La ritenzione si basa principalmente sulle proprietà fisiche delle proteine. Ad esempio, proteine solubili che fanno parte di grandi complessi non entrano in vescicole di trasporto.

2- Il recupero: le molecole “sfuggite” vengono riportate di nuovo nel comparto in cui risiedono normalmente. Le proteine che risiedono nel RE contengono alla loro estremità C-terminale corte sequenze che servono da segnali di recupero (KDEL per proteine solubili e KKXX per proteine della membrana) che vengono riconosciute da recettori specifici che si legano al rivestimento COPI.

Il segnale di recupero KDEL per le proteine solubili (e KKXX per proteine della membrana) viene riconosciuto da recettori specifici che si legano al rivestimento COPI.

Le proteine vengono ritrasportate indietro al RE per essere riciclate.

Ogni compartimento della via biosintetica ha il suo proprio e unico segnale di recupero.

Le vescicole in uscita dal RE e quelle in arrivo al RE sono localizzate in siti distinti?

E se sì cosa stabilisce questa distinzione spaziale?

I siti di uscita dal RE sono distinti dai siti di entrata (riciclaggio).

Nel RE c’è un complesso (DsI) che interagisce con le vescicole COPI in arrivo a specifici siti di arrivo (ERAS: ER arrival sites).

Questo previene il targeting sbagliato ai siti di uscita dal RE ERES che sono adiacenti (ERES: ER exit sites).

Quindi il complesso DsI impedisce che le vescicole COPI si avvicinino ai siti ERES!

Smistamento e trasporto di enzimi lisosomali

Le proteine lisosomali sono sintetizzate sui ribosomi legati alla membrana del RE e trasportate al complesso di Golgi insieme ad altri tipi di proteine.

Una volta entrate nelle cisterne del Golgi, le proteine lisosomali vengono riconosciute da enzimi che in due tappe catalizzano l’aggiunta di un gruppo fosfato a certi zuccheri mannosio delle catene carboidrati N-linked.

Così, gli enzimi lisosomali possiedono residui di mannosio fosforilati (mannosio-6-fosfato) che funzionano come segnali di riconoscimento. Questo segnale è riconosciuto dai recettori per il mannosio-6-fosfato (MPR) nel TGN; queste molecole vengono poi trasportate in vescicole rivestite da clatrina.

Cosa causa la dissociazione dell’enzima lisosomale dal recettore M6P? Il pH basso.

La modificazione post-traduzionale (fosforilazione dei residui di mannosio) che funge da segnale di riconoscimento degli enzimi lisosomali.

Endocitosi

Endocitosi mediata da recettori

Le cellule hanno recettori per l’assunzione di molti differenti tipi di ligandi, quali ormoni, fattori di crescita, enzimi e proteine plasmatiche. I recettori sono concentrati in aree specializzate della membrana conosciute come fossette rivestite.

Le fossette rivestite sono riconoscibili al microscopio elettronico come siti dove la superficie è incavata e la membrana è ricoperta, sul lato citoplasmatico, da uno strato di materiale elettron-denso, costituito dalla proteina clatrina.

La fossetta rivestita si invagina verso l’interno della cellula per formare una gemma rivestita. La membrana si stacca per dar luogo a una vescicola che contiene la proteina legata ai recettori nel lume e la clatrina sul versante citosolico.

Endocitosi mediata da clatrina

1) Clatrina è reclutata alla membrana dal complesso adattatore AP2. AP2 interagisce con fosfolidipi di membrana e la proteine integrale di membrana sinaptotagmina.

2) La formazione del rivestimento richiede anche altre proteine come AP180.

3) La GTPasi dinamina si accentra al sito di distacco della vescicola endocitotica e ne causa la costrizione. Dinamina agisce in modo simile a Sar1/Arf1.

4) Le vescicole sono rilasciate all’interno della cellula ed il rivestimento di clatrina viene rapidamente rimosso da specifiche ATPasi.

Occhio, che le vescicole rivestite da CLATRINA originano anche per gemmazione dal TRANS-Golgi Network e trasportano ad esempio enzimi lisosomali.

Il rivestimento di una fossetta (vescicola endocitotica) osservabile sul versante citoplasmatico mostra una rete di poligoni che assomigliano ad un nido di api. La costruzione geometrica del rivestimento deriva dalla struttura delle unità di clatrina.

Ciascun molecola di clatrina è costituita da tre catene pesanti e tre catene leggere unite a formare una struttura a tre gambe chiamata trischelio. Le molecole di clatrina si sovrappongono in modo tale che ciascun vertice di un poligono contiene un centro di uno dei trischeli componenti.

Il percorso endocitico

Ci sono due tipi di recettori che sono soggetti ad endocitosi:

1- Recettori di mantenimento

2- Recettori di segnale

I recettori di mantenimento sono responsabili dell’assunzione di materiali che saranno utilizzati dalla cellula. Esempi includono recettori per la trasferrina e per le LDL, che mediano il trasporto del ferro e del colesterolo.

L’endocitosi del primo gruppo di recettori è seguita dal trasporto del materiale legato e dal ritorno del recettore sulla superficie cellulare per un ulteriore ciclo di assunzione.

I recettori di segnale sono responsabili del legame di ligandi extracellulari che inducono cambiamenti nell’attività della cellula. Esempi includono recettori per ormoni e per fattori di crescita che innescano una risposta fisiologica all’interno della cellula.

L’endocitosi dei recettori di segnale è spesso seguita dalla distruzione del recettore, un processo chiamato regolazione negativa dei recettori, che ha l’effetto di ridurre la sensibilità della cellula a ulteriori stimolazioni, creando un periodo di refrattarietà verso ulteriori segnali finché nuovi recettori non vengono espressi sulla superficie cellulare.

Esosomi

Gli esosomi sono microvescicole che derivano dai mutivescicular bodies (MVBs).

Le cellule secernono continuamente un gran numero di diversi tipi di microvescicole comprese le macro e micro-molecole nei fluidi extracellulari. Una di queste cellule sono gli esosomi, che sono vescicole di dimensioni nanometriche in grado di trasferire i DNA, microRNA, RNA non codificanti e lipidi con o senza contatto diretto tra cellule, rappresentando così una nuova modalità di comunicazione intracellulare.

Gli esosomi sono secreti da tutti i tipi delle cellule e si trovano anche in abbondanza nei fluidi corporei come: saliva, sangue, urina e latte materno. Il principale ruolo degli esosomi è quello di trasportare le informazioni da consegnare ai vari effettori o di segnalazione molecole tra cellule specifiche.

Struttura degli esosomi

Gli esosomi sono in grado di ospitare un'ampia gamma di molecole, tra cui virus, materiale di acido nucleico (RNA, DNA) e microRNA a seconda di diversi fattori, tra cui il tipo o l'origine della cellula. Altri fattori che influenzano il contenuto di esosomi includono lo stato patologico dell'organismo ospite. Il contenuto degli esosomi può essere trasferiti dalla cellula d'origine alle loro cellule bersaglio nel microambiente locale o anche a livello di sito distante che può dare origine a reti di comunicazione intercellulare esponenziali.

Una volta secreti, gli esosomi possono interagire con le cellule bersaglio per modificare la loro funzione.

Gli esosomi secreti agiscono come messaggeri locali o paracrini.

Inoltre, possono raggiungere fluidi biologici, come come sangue, liquor, urina, ecc. e agiscono come messaggeri lontani.

Gli esosomi: i messaggeri della salute e della malattia

Gli esosomi sono piccole vescicole costituite da un doppio strato lipidico contenente varie proteine, RNA e lipidi bioattivi. Agiscono come messaggeri intercellulari che danno la capacità di comunicare tra entrambe le cellule dello stesso tipo e un'altra cellula. Vengono rilasciati dalle cellule sane, sia costitutivamente che dopo l'attivazione cellulare e svolgono un ruolo importante nella funzione del sistema immunitario. Gli esosomi sono essenziali per condizioni fisiologiche sane, tuttavia in condizioni patologiche circostanze, agiscono per potenziare lo stress e il danno cellulare. Questa recensione esplora le caratteristiche, la biogenesi, ruolo(i) nella patogenesi delle malattie e ruolo(i) nella progressione del cancro di questi messaggi in vescicola di dimensioni nanometriche: esosomi.

Origine degli organuli

Teoria endosimbiontica:

i mitocondri sono considerati strutture di origine batterica inglobate per fagocitosi da una cellula eucariota primitiva
La membrana è derivata dalla cellula procariotica, che ha successivamente dato origine al reticolo endoplasmatico, all’apparato del Golgi, al rivestimento nucleare e a quello degli organuli.

I sistemi di degradazione cellulare

Autofagia, Lisosomi ed autofagia mediata da chaperoni
Sistema ubiquitina proteasoma

Autofagia

I lisosomi hanno anche un ruolo chiave nel turnover degli organelli, cioè nella loro distruzione regolata e sostituzione.

Durante il processo di autofagia, un organello viene circondato da una doppia membrana in modo da costituire una struttura detta autofagosoma. L’origine della doppia membrana rimane incerta.

L’autofagosoma si fonde poi con un lisosoma formando un autofagolisosoma in cui l’organello inglobato è degradato ed i prodotti di degradazione sono resi nuovamente disponibili per la cellula.

Una volta che il processo digestivo è stato completato, l’organello diventa un corpo residuo.

Il corpo residuo può essere eliminato per esocitosi o può essere trattenuto nel citoplasma indefinitamente come granulo di lipofuscina.

I granuli di lipofuscina aumentano di numero mano a mano che un individuo invecchia.

L’accumulo è evidente in cellule che vivono a lungo come i neuroni, dove questi granuli sono considerati una caratteristica importante del processo di invecchiamento.

L’autofagia si sarebbe evoluta come una risposta alla scarsità di sostanze nutritive. Se una popolazione cellulare viene privata dei nutrimenti (starvation), essa attiva l’autofagia. In queste condizioni, la cellula ottiene l’energia per la sua sopravvivenza, cannibalizzando parte dei suoi organelli. Se la cellula non riesce ad adattarsi, induce il suo suicidio mediante apoptosi.

La modificazione post-traduzionale (lipidazione) di LC3-I in LC3-II è essenziale al fine di indurre la formazione delle vescicole autofagiche.

Che cosa degrada l’autofagia o macroautofagia?

Per lungo tempo si è creduto che l’autofagia fosse un processo di degradazione non selettivo che degrada, mediante invaginazione all’interno di una vescicola a doppia membrana, materiale citoplasmatico di varia natura, compresi organelli subcellulari.

Recenti studi dimostrano che il processo di macroautofagia (o autofagia) è altamente selettivo grazie alla cooperazione con specifici fattori e chaperoni molecolari, che permettono di convogliare specifici substrati agli autofagosomi.

Inoltre sono state individuate forme di autofagia che degradano in modo selettivo specifici substrati proteici o organelli subcellulari o aggregati proteici:

Autofagia mediata da chaperoni o CMA: degrada solo le proteine che hanno il motivo KFERQ-like:

Mitofagia: degradazione di mitocondri
Ribofagia: degradazione di ribosomi
Aggrefagia: degradazione di aggregati proteici
«Pexophagy»: degradazione dei perossisomi
Xenophagy: degradazione di microbi e patogeni esterni
Microfagia: targeting di proteine citosoliche a late endosomi

Il proteasoma

La degradazione delle proteine cellulari è svolta da “macchine” a forma di cilindri cavi, dette proteasomi, presenti sia nel nucleo che nel citoplasma delle cellule.

I proteasomi sono costituiti da quattro subunità polipeptidiche a forma di anello, impilate l’una sull’altra e con un cappuccio attaccato a ciascuna estremità.

I due anelli centrali sono costituiti da polipeptidi (subunità ) che agiscono come enzimi proteolitici.

I siti attivi di queste subunità si affacciano verso la parte centrale del complesso, dove la digestione proteolitica può avvenire in un ambiente protetto.

Catena di ubiquitina: segnale di degradazione proteasomale

Proteine che sono destinate ad essere distrutte vengono legate da un certo numero di ubiquitine, attaccate l’una all’altra a formare una catena di poliubiquitina (passaggio 1). L’ubiquitina è trasferita enzimaticamente da una proteina carrier su un residuo di lisina della proteina da eliminare.

Enzimi che trasferiscono l’ubiquitina alle proteine bersaglio costituiscono una grande famiglia di ubiquitina ligasi, i cui diversi membri sono in grado di riconoscere differenti segnali di degradazione.

Una volta poliubiquitinata, la proteina viene riconosciuta dal cappuccio del proteasoma (passaggio 2), il quale rimuove la catena di ubiquitina e denatura la proteina bersaglio usando l’energia fornita dall’idrolisi dell’ATP.

Il polipeptide lineare così ottenuto viene quindi infilato attraverso la stretta apertura nell’anello della subunità e portato nella camera centrale del proteasoma (passaggio 3).

Il polipeptide viene poi degradato in piccoli peptidi grazie all’attività catalitica delle subunità (passaggio 4).

I prodotti peptidici vengono quindi rilasciati nel citosol (passaggio 5), dove sono degradati nelle loro unità amminoacidiche.

Perossisomi

I perossisomi sono organelli con una sola membrana che contengono enzimi (ossidativi) coinvolti in numerose reazioni metaboliche.

I perossisomi contengono l’enzima catalasi che scinde il perossido di idrogeno (H2O2), tossico per la cellula, in acqua e ossigeno, rendendolo innocuo.

La funzione principale dei perossisomi è quella di degradare gli acidi grassi e quindi si trovano in gran numero nelle cellule che sintetizzano, immagazzinano o degradano i lipidi.

I perossisomi di cellule renali ed epatiche detossificano composti tossici come l’etanolo/alcol, fenoli, formaldeide, nitriti.

Mitocondri

I mitocondri sono presenti a centinaia nelle cellule eucariotiche (animali e vegetali).

Il loro numero aumenta con la richiesta energetica delle cellule.

Sono composti da:

- matrice, contiene ribosomi, DNA ed enzimi che partecipano alla respirazione cellulare

- creste, contengono molecole cruciali per la produzione di adenosina trifosfato (ATP).

Sono la centrale energetica della cellula, la sede della respirazione aerobica cellulare: processo che usa ossigeno per trasformare i lipidi e carboidrati contenuti nel cibo in molecole di adenosina trifosfato (ATP).

Il DNA mitocondriale

I mitocondri sono organuli provvisti di un loro proprio genoma, il DNA mitocondriale (mtDNA), costituito da una singola molecola di DNA circolare, contenuta nella matrice.

mtDNA codifica per la sintesi di alcuni tRNA, rRNA ed alcune proteine mitocondriali.

É considerato un organulo semiautonomo!

I mitocondri si dividono per scissione, raddoppiando il loro numero.

Tutti i mitocondri di una cellula eucariotica sono prodotti dalla divisione di mitocondri pre-esistenti!

Vi sono numerose analogie fra mitocondri e batteri:

- dimensioni e forma simili;

- DNA circolare;

- modalità di divisione simili;

- capacità di antibiotici di inibire la sintesi proteica a livello di ribosomi 70S batterici e ribosomi mitocondriali (ma non ribosomi eucariotici).

Pertanto, si ipotizza che i mitocondri derivino da antichi batteri aerobi, che avrebbero stabilito con eucarioti rapporti di simbiosi mutualistica.

Matrice extracellulare

La matrice extracellulare (ECM) è composta da:

carboidrati
proteine fibrose, prodotte dalle cellule

Tra le proteine troviamo:

collagene = principale proteina strutturale della ECM
fibronectine = glicoproteine che contribuiscono all'organizzazione della ECM. Esse si legano a recettori di membrana, legando ECM alla cellula
integrine = recettori per la ECM localizzati sulla membrana plasmatica che permettono l'adesione fra ECM ed i filamenti intermedi. Esse trasmettono anche le informazioni provenienti dalla ECM e contribuiscono al mantenimento della forma cellulare

Gli stress meccanici sono trasmessi da cellula a cellula dai filamenti citoscheletrici ancorati a livello dei siti di adesione cellula-matrice e cellula-cellula.
La ECM sostiene direttamente gli stress meccanici della tensione e della compressione.

Funzioni della matrice extracellulare

Tra le funzioni troviamo:

ancoraggio alla membrana basale
facilita o inibisce la migrazione cellulare
si lega a fattori di crescita e funge da luogo di stoccaggio, generando un gradiente di concentrazione
alcuni componenti della ECM legano selettivamente alcuni fattori di crescita e li presentano a recettori
produce frammenti di ECM funzionali
funge da rilevatore e trasmettitore degli stimoli meccanici
converte i segnali meccanici in chimici
comunicazione tra interno ed esterno

La perdita di contatto di una cellula con la matrice extracellulare può portare alla sua morte mediante un processo apoptotico noto come anoikis.

Membrana plasmatica

La membrana plasmatica è una barriera selettivamente permeabile tra il citoplasma e l'ambiente extracellulare.
Essa è costituita da un doppio strato di fosfolipidi contenente una grande quantità di proteine, glicoproteine, glicolipidi e colesterolo.
Le proteine di membrana sono dette:

integrali = se sono immerse nel doppio strato fosfolipidico
periferiche = se si trovano solo su uno dei due lati della membrana

Essa ha una struttura con modello a mosaico fluido, ossia la membrana è costituita da un doppio strato lipidico fluido e da un mosaico di proteine associate in continuo cambiamento.
L'organizzazione del doppio strato lipidico dipende dalla natura anfipatica dei fosfolipidi, con testa polare e coda apolare.
La composizione lipidica della membrana è eterogenea e ne influenza le caratteristiche e funzioni.
Le proprietà fisiche della membrana sono influenzate dalla loro composizione lipidica.
Gli acidi grassi insaturi ne promuovono la fluidità.
Gli acidi grassi saturi ne limitano la fluidità.
La lunghezza delle catene aciliche e la presenza di steroli (colesterolo) influenzano lo spessore delle membrane.
Il grado di curvatura della membrana dipende dalla forma dei lipidi, che a sua volta dipende dal ratio fra l'area delle teste polari e delle code aciliche.
Lipidi con un ratio testa/coda acilica uguale non generano curve nella membrana.
Non tutte le membrane sono uguali in termini di composizione ed hanno funzioni diverse.
Dalla tipologia di lipidi dipenderà anche la tipologia di proteine transmembrana presenti nei doppi strati lipidici.

Fluidità della membrana

I doppi strati fosfolipidici si comportano come dei cristalli liquidi, nei quali le molecole lipidiche si organizzano ordinatamente con le teste rivolte verso l'esterno e le code di acidi grassi verso l'interno del doppio strato.
I singoli fosfolipidi si muovono di continuo, navigando tra gli altri e permettendo alla membrana plasmatica di deformarsi e pertanto di essere fluida.
I movimenti permessi sono:

rotazione libera introno al proprio asse
movimenti laterali liberi
flip-flop, passaggio da un foglietto all'altro (evento raro)

Il colesterolo influenza moltissimo la fluidità di membrana, poiché impedisce il suo irrigidirsi con l'abbassarsi della temperatura o di divenire troppo fluida al suo aumentare.
Anche il grado di insaturazione degli acidi grassi delle code fosfolipidiche influenza la fluidità delle membrane.

I fosfolipidi costituiscono la struttura di base mentre le proteine di membrana sono responsabili delle sue funzioni.
Le proteine integrali sono anfipatiche, con regioni idrofiliche estese all'interno o all'esterno della cellula e porzioni idrofobiche inserite nella membrana.
Le proteine di transmembrana si estendono completamente nella membrana.
Le proteine periferiche sono legate a proteine integrali.
Le proteine periferiche si legano con legami non covalenti alle regioni idrofile delle proteine integrali o alle teste polari dei fosfolipidi.
Entro certi limiti e con velocità inferiori anche le proteine si possono spostare all'interno della membrana. Le proteine fluttuano nei fosfolipidi.

Permeabilità della membrana

La membrana è permeabile a diverse molecole e impermeabile ad altre.
Tra i principi di permeabilità troviamo l'osmosi.
L'osmosi è la diffusione dell'acqua attraverso una membrana semipermeabile, da una soluzione ipotonica a una soluzione ipertonica.

Trasporti

I trasporti possono essere di due tipologie:

attivo = ha bisogno di energia per essere fatto, esso avviene contro il gradiente di concentrazione. Esso è sempre mediato da un trasportatore
passivo = non ha bisogno di energia per essere fatto, esso avviene secondo il gradiente di concentrazione e si divide in:
diffusione semplice
diffusione facilitata grazie alla presenza di canali
diffusione facilitata grazie alla presenza di trasportatori

Diffusione semplice

La molecola si sposta da una regione a maggior concentrazione verso una a minor concentrazione, ovvero seguente il proprio di gradiente di concentrazione.
Le molecole più piccole, come l'acqua, e quelle solubili nei lipidi attraversano facilmente la membrana per diffusione semplice. Le molecole grandi o datate di carica elettrica diffondono con difficoltà.

Diffusione facilitata con i canali ionici

Una proteina di trasporto rende la membrana permeabile ad un determinato soluto, sia esso uno ione o molecola polare.
I canali ionici sono porine, ovvero proteine che formano pori larghi e permissivi, che lasciano passare acqua e determinati soluti.

I canali ionici sono controllati, in quanto possono essere aperti o chiusi per regolare il passaggio di ioni.

I canali ionici trasportano specifici ioni secondo il loro gradiente, ovvero sempre da una regione a maggior concentrazione ad una a minor concentrazione.

Diffusione facilitata con proteine carrier

Il trasporto attraverso le proteine carrier è più lento di quello dei canali ionici. Le fasi sono:

la proteina carrier lega una o più molecole di soluto
la proteina carrier subisce un cambiamento conformazionale che determina lo spostamento del soluto
la proteina carrier ritorna alla sua conformazione originaria

Trasporto attivo

Esso è il trasporto contro gradiente di concentrazione, le sue caratteristiche sono:

richiede apporto di energia
è mediato da proteine intrinseche di membrana che legano selettivamente un determinato soluto e lo trasportano dall'altro lato della membrana in seguito a modifiche conformazionali

Il principale trasportatore è la pompa sodio-potassio (Na/K ATPasi).
Essa usa l'energia dell'ATP per fosforilare la proteina carrier e cambiare la sua conformazione.
Vengono così portati 3 ioni sodio nell'ambiente extracellulare e 2 ioni potassio in quello intracellulare.
Si genera un gradiente elettrico (carica netta positiva all'esterno della membrana ad ogni ciclo).

Tipi di trasporto attivo

I tipi di trasporto attivo sono:

uniporto = trasporto di solo un tipo di sostanza in una sola direzione
simporto = trasporto di due sostanze nella stessa direzione
antiporto = trasporto di due sostanze in direzioni opposte

Solo piccole molecole (peso molecolare < 60 kDa) possono diffondere attraverso l'involucro nucleare. Proteine con preso molecolare più elevato e complessi RNA-proteine sono trasportati mediante sistemi di trasporto attivo attraverso i pori nucleari.

Poro nucleare

Il poro nucleare è un foro sulla membrana nucleare che consente il passaggio di determinate proteine mediante endocitosi e esocitosi.

Endocitosi

L'endocitosi è quel trasporto di membrana dove le macromolecole e le particelle vengono impacchettate all'interno di vescicole delimitate da membrana e portate all'interno.
Ci sono tre tipologie di endocitosi:

fagocitosi (assunzione di materiale solido)
pinocitosi (assunzione di materiale liquido)
endocitosi mediata da recettori (o captazione)

Fagocitosi

La fagocitosi è un tipo di endocitosi usato dalle cellule per ingerire grandi particelle o un organismo vivente come un batterio o cellule morte.

Durante il processo di fagocitosi, la membrana si ripiega per includere le particelle/cellule da fagocitare.
La membrana si fonde poi nel punto di contatto per formare un vacuolo che si fonderà con i lisosomi per degradare il materiale ingerito.

Ma come fanno i fagociti a riconoscere cellule morte/apoptotiche per poi fagocitarle?
La cellula apoptotica rilascia sostanze specifiche dette “find-me”. I “Find-me signals” sono riconosciuti e legati da specifici recettori presenti sulla membrana plasmatica dei fagociti.
La cellula apoptotica presenta sulla membrana molecole di fosfatidilserina (“eat-me signal”). Queste sono riconosciute dai recettori di adesione/eat-me receptor.

Pinocitosi

La pinocitosi è usata dalle cellule per introdurre materiale liquido extracellulare al loro interno, nel citoplasma.

Endocitosi mediata da recettore

Solo i ligandi che si legano ad uno specifico recettore presente nella membrana plasmatica possono essere incorporati mediante invaginazione della membrana.
L’invaginazione della membrana è promossa dalla polimerizzazione della proteina clatrina, che riveste le vescicole endocitotiche.

Formazione di una vescicola

Meccanismi possibili di formazione delle vescicole:

interazione tra adattatori e lipidi a livello della membrana plasmatica genera un nucleo che recluta altri adattatori e clatrina
la curvatura della membrana favorita da proteine con domini F-BAR aiuterebbe la formazione delle vescicole
il raggruppamento di molecole cargo induce l'assemblaggio di nuove vescicole endocitiche
specifici lipidi formano un gradiente lipidico o dominio lipidico che favorisce il reclutamento di adattatori alla membrana plasmatica inducendo in tal modo l'endocitosi

Esocitosi

L’esocitosi è un meccanismo usato dalle cellule per espellere prodotti di scarto o particolari prodotti di secrezione.
Il contenuto delle vescicole viene rilasciato mentre la vescicola viene incorporata nella membrana.
Le vescicole esocitotiche originano dal Golgi per gemmazione ed includono il materiale da secernere al momento della loro formazione.

Segnalazione cellulare

Una delle funzioni della membrana è quella di permettere la comunicazione tra cellule o tra queste e l’ambiente extracellulare.
Le cellule ricevono segnali e rispondono ad essi.
La comunicazione cellulare è essenziale per guidare la formazione e funzione dei tessuti ed organi, coordinare attività cellulari e metaboliche.
Le molecole responsabili dello scambio di informazioni sono fattori solubili o molecole segnale secrete dalla cellula.
Sono molecole segnale:

i neurotrasmettitori
gli ormoni
i fattori di crescita
le citochine

Anche l’ossido di azoto, un gas prodotto per deamminazione dell’arginina, una molecola segnale importante per la contrazione dei muscoli lisci (regola la pressione sanguigna).

La segnalazione cellulare avviene in 4 fasi:

invio di un segnale da parte di una cellula (rilascio di molecola segnale)
ricezione del segnale tramite un recettore di membrana; la molecola segnale si lega ad un recettore specifico. Generalmente non entra nella cellula bersaglio.
trasduzione del segnale, ovvero conversione del segnale extracellulare in un segnale intracellulare; questo viene trasmesso mediante via di segnalazione.
risposta, che modifica un processo cellulare.

I tipi di segnalazione cellulare

Segnalazione paracrina

I mediatori chimici locali diffondono localmente nel mezzo extracellulare, dove comunicano il loro messaggio a cellule riceventi che si trovano nelle immediate vicinanze.
Usano la segnalazione paracrina l’ossido di azoto, le citochine o i fattori di crescita.
Anche i neurotrasmettitori prodotti dalle cellule nervose hanno un raggio di azione molto ridotto.

Segnalazione paracrina e autocrina

In entrambi i tipi, il segnale è limitato alle altre cellule nell'area locale, ma la segnalazione paracrina influisce su cellule di tipo differente rispetto alla cellula che ha compiuto la secrezione, mentre quella autocrina influisce su cellule dello stesso tipo.

Segnalazione distante o endocrina

Le cellule endocrine riversano gli ormoni (molecole segnale) nel sangue. Queste molecole raggiungono con il circolo sanguigno bersagli lontani.

Segnalazione contatto-dipendente

Non vi è produzione di segnali solubili ma contatto fra le cellule tramite molecole specializzate situate sulle rispettive membrane plasmatiche o tra queste e la matrice extracellulare.
Fornisce importanti informazioni sulla posizione di una cellula in un tessuto/organo.

Tipi di recettori di membrana

Per poter rispondere ad un segnale le cellule necessitano generalmente di specifici recettori di membrana. Si distinguono:

recettori accoppiati a canali ionici
recettori accoppiati a proteine G
recettori collegati ad enzimi

Indipendentemente dal tipo di recettore, la sua attivazione comporta un suo cambiamento di conformazione, che ne attiva la funzione.

Il recettore comincia così una risposta inducendo dei cambiamenti a catena in proteine intracellulari che costituiscono la via di trasduzione del segnale.

Recettori accoppiati a canali ionici

Sono canali ionici con una parte della proteina che forma la «porta» che apre e chiude il canale.
La «porta» resta chiusa fino al momento in cui un ligando si lega al recettore.

Questi recettori si trovano nella membrana dei neuroni e delle cellule muscolari. Convertono segnali chimici in segnali elettrici, cambiando cosi la polarità della membrana.
L'acetilcolina agisce sia nel sistema nervoso periferico che centrale.
Nel sistema nervoso periferico, l'acetilcolina attiva i muscoli scheletrici.
Nel sistema nervoso centrale, l'acetilcolina partecipa ai processi di apprendimento.

Recettori accoppiati a proteina G: attivazione

Sono proteine transmembrana con 7 domini. Interagiscono con proteine G, che legano i nucleosidi fosfato GTP e GDP.
La proteina G consiste in 3 subunità (α,β e γ). Nella conformazione inattiva, il trimero è associato alla membrana e lega GDP.
L’interazione con il recettore induce il rilascio della subunità α che rilascia il GDP e lega il GTP.

Recettori accoppiati a proteina G: trasduzione del segnale

La subunità α della proteina G interagisce con l’enzima adenilato ciclasi, inducendo la sintesi di cAMP a partire da ATP.
cAMP è un secondo messaggero che veicola il segnale ed attiva la proteina PKA, che a sua volta fosforila proteine specifiche.
La subunità α della proteina G interagisce con l’enzima fosfolipasi C, inducendo la sintesi di diacil glicerolo (DAG) ed inositolo trifosfato (IP3) a partire da fostatidilinositolo difosfato (PIP2).
DAG attiva la proteina chinasi C (PKC) ed IP3 induce il rilascio di calcio.

Recettori accoppiati ad enzimi

Sono accoppiati a enzimi tirosina e chinasi.
Quando il segnale si lega, il recettore dimerizza e autofosforila i propri siti di tirosina.
Il recettore attivo ora fosforila proteine bersaglio nella cellula che a loro volta fosforilano in serina o treonina o tirosina altre proteine.

L’adesione tra le cellule

L’integrità degli organismi pluricellulari animali dipende dalla capacità delle cellule di associarsi per formare tessuti e organi.
Tali funzioni si realizzano attraverso strutture specializzate delle membrane chiamate giunzioni cellulari.
Esistono tre tipi di giunzione cellulari che permettono a due cellule di mantenere uno stretto contatto tra loro:

Giunzioni adesive o ancoranti
Giunzioni strette (serrate) od occludenti
Giunzioni comunicanti

Giunzione ancoranti

Le giunzioni ancoranti legano il citoscheletro di una cellula a quello di una cellula adiacente o alla matrice extracellulare.
Garantiscono la resistenza agli stress meccanici, necessaria per la stabilità dei tessuti.
Esistono tre tipi di giunzioni ancoranti:

giunzioni aderenti = connettono le cellule tra loro attraverso caderine che si legano nel citosol ai microfilamenti di actina. Hanno un ruolo nella motilità.
desmosomi = sono punti di contatto intercellulare a forma di bottone. Inoltre i desmosomi sono ancorati (mediante caderine) ai filamenti intermedi intracellulari. Conferiscono resistenza meccanica al tessuto.
emidesmosomi = simili ai desmosomi ma connettono le cellule alla matrice extracellulare tramite le integrine.

Giunzioni serrate

Le giunzioni serrate sono aree di connessione tra membrane di cellule adiacenti.
Sono cosi strette da fare scomparire completamente lo spazio extracellulare e impedire il transito di molecole.
Sono formate da proteine di membrana chiamate occludine (o claudine) che formano filamenti interconessi. I filamenti di cellule adiacenti si legano l’uno con l’altro, sigillando insieme le cellule.
Sono essenziali per bloccare il passaggio di sostanze dall’intestino al sangue o dal sangue al cervello (barriera emato-encefalica). Infatti, le molecole possono passare solo mediante trasporto selettivo e/o regolato.

Giunzioni comunicanti: GAP

Le giunzioni comunicanti (gap junctions) sono formate da canali (emicanali) composti da connessina, una proteina integrale di membrana.
Gli emicanali di due cellule adiacenti possono unirsi e formare un canale completo attraverso il quale possono passare ioni e piccole molecole di regolazione (cAMP, ATP, etc).
Quindi le GAP consentono lo scambio diretto di ioni e piccole molecole tra il citosol di due cellule adiacenti.
Invece, molecole di dimensioni più grandi vengono escluse.

Differenze fra giunzioni serrate (tight) e comunicanti (gap)

Le giunzioni comunicanti permettono alle cellule di comunicare e di scambiare ioni e piccole
molecole (fino a circa 1kDa).
Permettono anche di trasmettere segnali chimici ed elettrici fra cellule adiacenti .
I principali componenti delle giunzioni comunicanti sono le connessine.

Le giunzioni serrate sono caratterizzate dalla fusione di membrane di cellule adiacenti e si trovano solo nei tessuti epiteliali/endoteliali.
Prevengono il passaggio libero di sostanze attraverso le membrane, ed anzi lo regolano in maniera estremamente selettiva. Creano una vera e propria barriera.
Le giunzioni serrate sono anche importanti per determinare la polarità delle cellule epiteliali.
Infatti formano una barriera fra la zona apicale e la zona basolaterale delle cellule polarizzate
prevenendo la libera diffusione di proteine all’interno dei lipidi.
I principali componenti delle giunzioni serrate sono le occludine.
Le giunzioni serrate sono anche importanti per determinare la polarità delle cellule epiteliali.

Proteine e modificazioni post-traduzionali

Il DNA trascrive parte delle sue informazioni in RNA, che poi verrà trascritto in proteine

DNA→RNA→Proteine

La forma di una proteina è determinata dalla sua sequenza di aminoacidi.
Tre tipi di legami non covalenti aiutano le proteine a ripiegarsi nella loro struttura tridimensionale:

attrazione elettrostatica
ponti a idrogeno
attrazione di van der Waals

Ci sono 4 livelli di organizzazione nella struttura di una proteina;

struttura primaria = è costituita dalle sequenze di amminoacidi
struttura secondaria = è costituita da α-elica e foglietto β ripiegato
struttura terziaria = è il ripiegamento della struttura secondaria
struttura quaternaria = si origina dall'unione di più catena polipeptidiche

Protein folding = processo di ripiegamento molecolare attraverso il quale le proteine ottengono la loro struttura tridimensionale avviene sia durante la sintesi proteica, sia alla fine di questa.
Schemi di ripiegamento comuni: alfa elica e foglietto beta
Il foglietto β può essere antiparallelo o parallelo, ma in entrambi i casi ha una struttura rigida.

Le alfa eliche arricchite in catene laterali idrofobiche possono avvolgersi (da 2 a 4) una attorno all’altra formando il coiled coil.

Ripiegamento delle proteine

Se si tratta una proteine con agenti riducenti, essa perde la sua attività enzimatica.
Quando però, si rimuovono questi agenti dalla preparazione, le molecole riacquistano la loro normale attività enzimatica.
Lo srotolamento, o disorganizzazione, di una proteina è detto denaturazione e può essere causato da vari agenti (solventi, detergenti, radiazione, calore, composti come urea).
La sequenza amminoacidica di molti polipeptidi contiene tutta l’informazione per l’assemblaggio della conformazione tridimensionale della proteina (autoassemblaggio).

Folding proteico e stato nativo

Non tutte le proteine sono capaci di assumere la propria struttura terziaria mediante autoassemblaggio.
Non perché la struttura primaria sia priva dell’informazione richiesta per il giusto ripiegamento, ma perché si deve impedire che durante il ripiegamento essa interagisca in modo non selettivo con altre molecole (o che interazioni promiscue fra regioni idrofobiche di una stessa proteina avvengano).
Proteine pure ricombinanti possono incontrare difficoltà ad assumere la loro conformazione nativa a
più bassa energia e bassa entropia anche in vitro, ovvero in soluzione senza interferenza da parte di fattori esterni.
La situazione si complica all’interno delle cellule per varie ragioni:

alta concentrazione di componenti intracellulari (macromolecolar crowding)
presenza di supersaturazione = ovvero molte proteine sono presenti in concentrazioni molto alte, vicine al loro limite di solubilità; pertanto, queste proteine metastabili possono facilmente aggregare
stress cellulare, che può comportare la denaturazione delle proteine

Chaperoni molecolari

I chaperoni, o proteine chaperon, sono un gruppo di proteine che svolgono un ruolo cruciale nel processo di piegamento delle proteine all'interno delle cellule. Ecco alcune informazioni chiave sui chaperoni:

Funzione: I chaperoni aiutano le proteine a ripiegarsi nella loro forma tridimensionale corretta, che è essenziale per la loro funzionalità. Durante la sintesi proteica, le catene polipeptidiche possono ripiegarsi in modi errati, e i chaperoni intervengono per prevenire o correggere questi errori.
Meccanismo d'azione: I chaperoni possono legarsi a proteine nascenti o mal ripiegate e fornire un ambiente favorevole al corretto ripiegamento, spesso utilizzando energia derivante dall'ATP per facilitare il processo.

I chaperoni molecolari interagiscono in modo transiente con proteine che espongono residui idrofobici e le assistono nell'assumere il corretto ripiegamento.
Esse però, non fanno parte della proteina finale.
I chaperoni molecolari sono coinvolti in una grande quantità di attività intracellulari:

dall’assistenza nel folding di proteine di nuova sintesi
all’importo di proteine negli organelli
alla prevenzione dell’aggregazione di proteine
al recupero di un ripiegamento corretto da parte di un intermedio con struttura instabile
al targeting di proteine danneggiate verso i sistemi di degradazione cellulare

Dominio proteico

Il dominio proteico è una sottostruttura prodotta da una parte di una catena polipeptidica che si ripiega indipendentemente in una struttura stabile.
I domini sono associati a specifiche funzioni e sono ripiegati in strutture globulari.
Si ritiene che molti polipeptidi contenenti più di un domino si siano originati durante l’evoluzione mediante fusione di geni che codificavano per proteine ancestrali diverse, ciascun dominio corrisponderebbe a quella che una volta era una molecola distinta.
Tutte le proteine si legano ad altre molecole, i ligandi

anticorpo: lega l’antigene (proteina) di agenti patogeni (virus, batteri)
le molecole di actina si legano a formare i filamenti di actina
enzimi: legano un substrato e formano e rompono legami covalenti catalizzando reazioni enzimatiche e convertendo il substrato in un prodotto modificato (catalizzatori che accelerano le reazioni)

Sito di legame fra una proteina ed il suo ligando, il ciclico AMP. In esso i legami a idrogeno e forze elettrostatiche “stabilizzano” l’interazione fra proteina-ligando.

Le proteine usano diversi tipi di interfaccia per legare altre proteine:

superficie stringa = interazione fra dominio SH2SH_2SH2 e ansa polipeptidica fosforilata
elica-elica = due alfa-eliche si avvolgono (proteine che legano RNA)
superficie-superficie = adattamento di due superfici rigide stabilizzate da legami deboli fra le superfici (molto specifiche)

I legami non covalenti stabilizzano le interazioni fra proteine: quando le superfici non si adattano bene il numero di legami è basso e le molecole si attaccano e distaccano continuamente (A-B, A-C).

Modificazioni post-traduzionali delle proteine

Ci sono due modi per regolare l’attività delle proteine:

mediante legame reversibile ad altre proteine interazione enzima-substrato; interazione enzima-coenzima, ovvero un cofattore o un atomo di metallo che si associa al sito attivo e ne coadiuva la funzione
mediante modificazioni post-traduzionali aggiunta covalente di una piccola molecola su una o più catene laterali degli aminoacidi

Spesso una proteina può subire diverse modificazioni post-traduzionali, usate come codice regolatore combinatorio.

Fosforilazione

Mediante la fosforilazione si possono ottenere:

proteine chinasi = sono proteine che ricevono un atomo di fosforo dall'ATP
proteine fosfatasi = sono proteine che cedendo un atomo di fosforo

La fosforilazione può aumentare o diminuire l’attività di una proteina.

Ubiquitinazione = si aggiunge in modo covalente una proteina ad una proteina e ciò può regolarne la funzione, la localizzazione subcellulare e la degradazione.
L’ubiquitinazione è un processo multi-step che richiede 3 reazioni enzimatiche a cascata catalizzate dagli enzimi E1, E2 ed E3.
E1: enzima che attiva l’ubiquitina
E2: coniuga l’ubiquitina (30 diverse E2)
E3: ubiqutina ligasi che lega l’ubiquitina su un residuo di lisina (K) del substrato (centinaia di E3).

Alcune proteine vengono selezionate in quanto riconosciute come anormali o perché mal ripiegate o perché sono associate in modo non corretto con altre proteine.

La distruzione di altre proteine “normali” è basata sulla stabilità biologica della proteina. Ogni proteina possiede una longevità caratteristica. Ci sono proteine come enzimi che permangono per giorni o settimane. Altre proteine, necessarie per una specifica attività transitoria possono sopravvivere solo pochi minuti.

Il turnover di una determinata proteina può essere influenzato dalla sua localizzazione subcellulare.

Quindi, una proteina mostra curve di degradazione e, quindi turnover, diversi, in base al compartimento subcellulare nel quale essa si trova.

I fattori che controllano la durata di vita di una proteina non sono ancora pienamente conosciuti. Ecco un elenco di alcuni fattori:

Polipeptidi che terminano (quindi ultimo amminoacido presente all’estremità N-terminale) con l’arginina o la lisina, hanno generalmente emivite brevi.
Esistono anche proteine che presentano una specifica sequenza amminoacidica interna, chiamata “degron”, che garantisce che esse non sopravvivranno a lungo nella cellula.

La sequenza degron è riconosciuta dall’enzima E3 ligasi che poi recluta gli enzimi necessari per ubiquitinare il substrato ed indirizzarlo al proteasoma per la degradazione.

Ubiquitina

L’ubiquitina è una piccola proteina altamente conservata che svolge diverse funzioni in differenti processi cellulari.
L’ubiquitina è legata covalentemente ad una proteina target in vario modo.
In base a come e quante molecole di ubiquitina vengono legate alla proteina target, cambierà il suo significato funzionale, che può variare ampiamente da:

molecola segnale per regolare un’attività cellulare
a segnale di degradazione della proteina legata

Esistono molti diversi tipi di ubiquitinazione: mono, multi e poli-Ub.
Le proteine target possono contenere una o più molecole di ubiquitina, in forma:

monomerica
in forma di catena formata da varie molecole di ubiquitina

Le catene di poliubiquitina possono poi essere lineari o ramificate.

In sintesi, le modificazioni post-traduzionali (PTM) delle proteine possono essere reversibili o irreversibili.
Le PTM reversibili sono etichette aggiunte mediante legame covalente su specifici residui delle proteine che ne possono influenzare turnover e stabilità, l’interazione con altre proteine, l’attività enzimatica, l’affinità di legame ad acidi nucleici o membrane. Le PTM svolgono un ruolo fondamentale nel regolare attività, o localizzazione, o interazioni proteina-proteina o con acidi nucleici o membrane e diversificano il proteoma

Separazione di fase liquido-liquido ed organizzazione dei componenti intracellulari nello spazio e nel tempo

Ci sono tre categorie di proteine:

piegate (folded), in cui la struttura = funzione
piegate con disordini (folded with IDRS), in cui la struttura = funzione e disordine = funzione
disordinate (IDR), in cui il disordine = funzione

Le regioni intrinsecamente disordinate (IDR) sono segmenti di polipeptide che non contengono sufficienti aminoacidi idrofobici a mediare la cooperativa pieghevole. Invece, loro in genere contengono una proporzione più alta di amminoacidi polare o aminoacidi caricati. Così, gli IDR mancano di una struttura tridimensionale o interamente o in parte nel loro stato nativo. Generalmente sono in equilibrio dinamico sotto condizioni fisiologiche.

Alcune regioni apparentemente disordinate assumono conformazioni specifiche in seguito all’interazione con il loro substrato biologico; oppure costituiscono linker flessibili fondamentali per l’assemblaggio di complessi macromolecolari.

Le funzioni delle IDR sono:

regioni NON strutturate fungono da siti di legame specifici per altre proteine
regioni disordinate contengono siti di modificazione post-traduzionale e sono coinvolte nella segnalazione
regioni disordinate possono tenere due domini vicini per favorire la loro interazione
regioni disordinate costituiscono una barriera di diffusione

Condensati molecolari

Molti compartimenti cellulari (condensati) non sono legati da membrane; eppure concentrano proteine e acidi nucleici in siti cellulari discreti.
Poiché non hanno una barriera fisica per separare le loro componenti dell'ambiente circostante, come possono:

concentrare le molecole
mantenere e regolare le loro strutture
controllare le loro composizioni
modulare le attività biochimiche interne

Compartimenti liquidi separati per fase
e il processo della separazione di fase liquido-liquido (LLPS) come organizzatori della biochimica cellulare

Il citoplasma assomiglia e si comporta come una miscela di gocce sospese differenti chimicamente.

I condensati biomolecolari cellulari sono altamente complessi. In molti casi la fase diluita (circondata da citoplasma o nucleoplasma) è molto più larga rispetto al biocondensato.
Come risultato, le molecole che si arricchiscono e diventano molto concentrate nel biocondensato può essere molto abbondante (in termini di numero di molecole) nella fase diluita.

Principi chimico-fisici sotto LLPS

Entropia ed energia libera

L'entropia è la misura del disordine, nello specifico essa misura il numero di possibilità in cui le molecole possono disporsi.

I sistemi tendono ad evolvere in stati a maggior disordine.
I sistemi ordinati tendono a mischiarsi in uno stato ordinato meno omogeneo.
L'energia che guida la separazione di fase arriva dall'energia di interazione tra molecole vicine.
Quando l'interazione tra molecole simili è più forte rispetto a quella tra molecole differenti la separazione di fase avviene.
La separazione di fase si verifica quando un aumento in concentrazione supera la tendenza della soluzione a rimanere misto in modo omogeneo.
La separazione di fase e il miscelamento si verificano quando la concentrazione di soglia critica è raggiunta.
Una proteina forma gocce di liquido dense sopra la concentrazione critica per la separazione di fase. Le gocce di liquido sono stabili fintanto che la concentrazione totale è sopra la soglia critica.
Le gocce formano un compartimento che permette la diffusione di molecole all'interno del compartimento e promuovono lo scambio dinamico di molecole con la fase circostante diluita.
Una volta che la concentrazione totale della proteina scende ancora al di sotto della concentrazione critica, i compartimenti dissolvono.
Modificazioni post-traduzionali o cambiamenti in temperatura o forza ionica possono aumentare l'affinità per l'interazione proteina-proteina, poi l'abbassamento della soglia critica per la separazione di fase e permettendo la formazione di compartimenti ad una concentrazione di proteine molto più bassa.

Senza separazione di fase, una concentrazione locale di molecole scala linearmente con la concentrazione in massa, risultando con in effetti ridotti.

La separazione di fase consente una forma, risposta simile a quella di un interruttore come la concentrazione della biomolecola di separazione di fase eccede la concentrazione di saturazione (Csat).
Un piccolo cambiamento della concentrazione di massa può portare a un improvviso cambiamento in una concentrazione locale di molecole, e potrebbe portare a grandi cambiamenti in attività/segnale.

Tensione superficiale

La tensione superficiale fa si che le gocce di liquido adottino la loro tipica forma sferica.
Sotto la superficie le attrazioni molecolari tra molecole le spingono in ogni direzione portando come risultato una forza nulla.

Quando un liquido non è confinato in un contenitore la direzione netta della forza
che preme sulle molecole in superficie è verso il centro, spiegando perché i liquidi adottino come forma sferica la goccia.

Affinità di legame

La separazione di fase dei biopolimeri è spesso guidata da molte interazioni deboli.
L’affinità di legame è influenzata da interazioni intermolecolari non covalenti come:

legami a idrogeno
interazioni elettrostatiche
forze di van der Waals

L’affinità è la forza di legame di una singola molecola al suo ligando. Essa è misurata e riportata dalla costante di dissociazione di equilibrio (KD).
In base alla avremo:

alta affinità per bassi valori di
bassa affinità per altri valori di

Caratteristiche molecolari che guidano la transizione di fase biologica

Interazioni tra proteina-proteina, proteina-acido nucleico e acido nucleico-acido nucleico possono guidare la separazione di fase.
La separazione di fase liquido-liquido richiede macromolecole multivalenti: proteine intrinsecamente disordinate e proteine multidomio.
Proteine modulari = alcuni domani legano ad altri domini o un motivo in un’altra proteina, abilitando la formazione di networks di proteine.

Domini di proteine

I domini di proteine sono unità modulari importanti per la funzione della proteina.
Proteine intrinsecamente disordinate
Le regioni intrinsecamente disordinate non hanno una struttura secondaria e terziaria stabile. Esso adottano un assemblamento dinamico della conformazione.
Diversamente alla loro controparte piegata, queste sequenze proteiche mancano della struttura terziaria e popolano un insieme eterogeneo di conformazioni con un’alta accessibilità ai solventi.
Il grado di disordine può variare tra differenti proteine.
I maggiori elementi funzionali si trovano all’interno degli IDR, infatti esse portano due tipi di sequenze con ruoli regolatori documentati: le regioni a bassa complessità (LCRs) e i motivi lineari brevi (SLiMs).
Le LCRs hanno forma dinamica e networks non stechiometrico.
Le SLiMs mediano in modo selettivo interazioni bipartite con domini piegati.

Le LCRs sono proteine non globulari e differiscono dalla composizione e dalla complessità di molte proteine globulari. Esse contengono semplici sequenza ripetute.

Le SLiMs sono microdomini proteici funzionali che mediano l’interazione tra una regione a linea breve in una proteine e un dominio globulare in un’altra.

Proteine intrinsecamente disordinate (IDP) e proteine multidominio con linker flessibili mostrano un alto livello di eterogeneità strutturale e sono meglio descritti da insiemi costituiti da molteplici conformazioni.

La determinazione degli insiemi conformazionali di solito implica l'integrazione di esperimenti biofisici e modelli computazionali.

Dominio: una regione proteica che si ripiega in una struttura terziaria definita (tridimensionale struttura).

Interazioni multivalenti guidate da LLPS

L’effetto multivalente è definito come un’interazione con siti multipli di legame.

Esistono vari tipi di interazioni multivalenti.

Livelli atomici e molecolari e vari tipi di interazioni definiscono i condensati.

Si ritiene che le interazioni a bassa affinità guidino la separazione fase omotipica degli sfollati interni

Goccioline di FUS, DDX4 e LAF-1 derivano da molteplici interazioni su scala nanometrica mostrate sopra.

Livelli atomici e molecolari e la valenza delle interazioni definiscono i condensati: multivalenza. Queste interazioni, a loro volta, definiscono la composizione del condensato.

Insieme, tutto in piccola scala le interazioni modulano il rete biomolecolare di la comunità molecolare.

Queste interazioni e le comunità molecolare, a sua volta, definiscono le proprietà del materiale del condensato.

Le interazioni che si verificano per le proteine contengono domini intrinsecamente disordinati (IDR), sono mediati da: dipoli, legami a idrogeno ecc.

Le interazioni proteina-proteina mediata da ripiegamenti di domini ripiegati possono guidare la separazione di fase.

I domini SH3 e i PRM sono gli adesivi, o piccoli modificatori correlati all’ubiquitna (SUMO) e motivi di interazione SUMO (SIMs).

Configurazione adesiva-e-distanziatore: più moduli di rilegatura piegata e/o brevi sequenze di interazione (adesivi) sono separate da spiegate o regioni disordinate (distanziatori), ottenendo così la multivalenza, promuovendo nucleazione di piccoli complessi e LLPS.

Il concetto di adesivi e distanziatori si applica anche alle proteine IDR.

Gln e Tyr sono considerati adesivi che potrebbero interagire mediante dipoli e stacking.

Il modo in cui vengono distribuiti gli adesivi e i distanziatori è importante.

Tre sequenze distinte di proteine intrinsecamente disordinate con numeri identici di residui di adesivi distribuiti in diverse disposizioni.

Per un numero fisso di adesivi, il modello di sequenza può aumentare o diminuire la valenza effettiva se i residui di adesivo sono raggruppati insieme, l'effettiva identità dell'adesivo può cambiare in modo tale che, come il il numero di adesivi diminuisce, il forza di ogni singolo adesivo aumenta.

Riepilogo delle diverse tipologie di adesivi e distanziatori per i diversi sistemi

Per i domini ripiegati, la mappatura di gli adesivi e i distanziatori sono realizzati attraverso la fisica dei colloidi irregolari, per cui gli adesivi sono i patch di interazione e distanziatori sono regioni del dominio globulare che fungono da impalcatura di superficie adesivi.

Per proteine multivalente lineare, gli adesivi sono i domini di legame ripiegati, mentre i distanziatori lo sono linker flessibili che connettere domini. Nota: regioni disordinate comprendono anche entrambi primaria o ausiliaria adesivi.

Anche le proteine monomeriche che formano oligomeri possono farlo subire la separazione di fase.

Le singole unità monomeriche non hanno le caratteristiche multivalenti per mediare LLPS. Una volta che le unità monomeriche si assemblano in strutture di ordine superiore (oligomeri), raggiungono la natura multivalente e quindi possono guidare LLPS.

Scaffold e clienti

Le biomolecole che separano le fasi sono spesso classificate come scaffold, che lo sono entrambi necessari e sufficienti per la separazione di fase.

I clienti possono partizionare selettivamente in scaffold-contenitori i condensati ma non possono separare la fase in modo indipendente.

Proprietà fisiche delle biomolecole di condensati: viscosità, tensione superficiale, viscoelasticità e diffusione macromolecolare.

I condensati biomolecolari possiedono caratteristiche liquide come la fusione, il flusso e lo scambio continuo di materiali tra la fase densa e quella diluita interni altamente dinamici capace di rapido riarrangiamento e scambio stocastico con la soluzione sfusa.

I condensati biomolecolari mostrano proprietà simili a quelle liquide.

Eventi dinamici di fusione, deformazione e fissione.

Influenza della tensione superficiale sulla morfologia del condensato e organizzazione interna.

Tensione superficiale: la superficie di un liquido si comporta come un sottile foglio elastico (camminamento degli insetti sull'acqua) quando il liquido non lo è confinato in un contenitore il direzione netta della forza tirando le molecole a la superficie è verso il centro, spiegando perché il i liquidi adottano la forma sferica forma: goccia (sferica).

Il nucleolo contiene 3 regioni distinte, con distinte funzioni

centro fibrillare: FC (sintesi del pre-rRNA 45S)
componente fibrillare densa: DFC (elaborazione dell'rRNA
componente granulare: GC (biogenesi ribosomiale)

La tensione superficiale governa le proprietà di equilibrio di condensati e la struttura gerarchica in multifasica condensati come i nucleoli.

Il nucleolare purificato dalla separazione di fase delle proteine in goccioline contenente distinti non coalescente fasi che sono notevolmente simile a nucleoli in vivo.

Nella miscela binaria, la separazione di fase porta alla formazione delle regioni arricchito con un componente in equilibrio, con una regione circostante arricchito con l'altro componente.

Nei sistemi biologici, le proteine non sono tipicamente in isolamento: la fase comportamento di qualsiasi dato la proteina è influenzata da proprietà e abbondanza dell'altro proteine nel suo ambiente.

In un sistema ternario, la forma dei diagrammi di fase può differire a seconda delle interazioni tra componenti.

Una regione trifase, oltre che distinta nella fase esistono regioni a due fasi spazio.

Nella regione trifase, due tipi distinti di goccioline liquide possono coesistere.

Sono stati utilizzati approcci computazionali come la modellazione reticolare utilizzato per comprendere (e prevedere) come si formano i condensati: simulazioni di interazioni tra proteine e con solvente.

I componenti sono classificati in base alla loro valenza:

valenza = 1: nessuna ulteriore crescita della rete
ponti (2 interazioni): espansione del condensato
nodi (>3 interazioni): espansione del condensato

Nei sistemi viventi multicomponente i condensati possono adottare un’organizzazione interna: differenti condensati biomolecolari mostrano architetture distinte.

Nei sistemi viventi, sequenze codificate da proprietà fisico-chimiche portano a condensati multicomponente e l’emersione di stati solidi da liquidi metastabili.

La metastabilità della fase liquida è collegata a stati condensati simili ai solidi

A seconda delle condizioni, una proteina può condensare in diverse strutture di ordine superiore: liquidi, solidi vetrosi o fibre amiloidi.

Solidi vetrosi arrestati dinamicamente sembrano formarsi.

I solidi liquidi e/o vetrosi possono maturare allo stato di fibra.

Guscio del nucleo solido-liquido

Condensati con questa struttura inizialmente formano dei nuclei proteici individuali, che poi accumulano molto materiale e uniti per formare strutture più grandi.

Guscio del nucleo liquido-solido

Condensati con questa struttura sono costituiti da un nucleo più liquido circondato da una proteina gelatinosa conchiglia.

Guscio del nucleo liquido-liquido

L'interno e l'esterno del condensato sono entrambi liquidi dinamici, ma sono composizionalmente distinti, tali come con gli anisosomi (iLSA). iLSA ha una guscio liquido TDP-43 (verde) e il gli interni sono arricchiti per HSP70 accompagnatori.

Nucleo di RNA

Negli ovociti di X. laevis, gli RNA devono localizzarsi correttamente per il successo dello sviluppo embrionale. Questa localizzazione è ottenuta, in parte, dalla formazione di Corpi L, composti da RNA e RBP. Nei corpi L si forma l’RNA un nucleo immobile avvolto da a rivestimento proteico dinamico. Colorazione per la proteina del corpo L hnRNPAB (verde) e L'mRNA vg1 (rosso) rivela il multifasico natura dei corpi L.

Guscio di RNA

Le proteine sono circondate da RNA. In paraspeckles, l'lncRNA NEAT1 si piega in modo che le sue estremità 3' e 5' siano rivolte verso l'alto verso l'esterno con la parte centrale al centro dove si accumulano le proteine.

In alternativa, gli RNA possono decorare l'esterno di un nucleo proteico, come con macchie nucleari. In questo situazione, un nucleo proteico (SC35) raccoglie molecole di RNA che risiedono all'esterno del condensa.

Gocce nidificate

Il nucleolo ha un’organizzazione tripartita, con il FC gelatinoso e DFC avvolto da un GC simile a un liquido. Ogni componente del nucleolo ha a funzione distinta e display distinti proprietà fisiche.

Condensati non sferici

Strutture atipiche come TIS11B granuli: estesi a rete assemblaggio composto da proteine e RNA. Condense TIS11B si intrecciano con l'ER, formando una complessa rete di tubuli.

Condensati non liquidi

Il corpo di Balbiani contiene una rete amiloidogenica formata da proteina Xvelo in X. laevis. Xvelo contiene un PrLD necessario per il suo autoassemblaggio, così come per la sua associazione con organelli, come mitocondri.

In sintesi

- Le cellule eucariotiche contengono molti organelli privi di membrana o condensati biomolecolari

- i condensati si formano attraverso un processo di separazione della fase liquido-liquido

- specifici principi fisico-chimici governano il LLPS: Entropia e libertà energia; Tensione superficiale; Affinità vincolante

- caratteristiche molecolari specifiche guidano le transizioni di fase biologica: Interazioni multivalenti e disordine intrinseco

- molteplici interazioni su scala nanometrica governano la formazione del condensato

- concetto di adesivi e distanziatori, concetto di ponteggio e clienti

- i condensati si comportano come liquidi: fusione, fissione, deformazione

- i condensati hanno un'organizzazione interna diversa e possono essere solidi (esempio del corpo Balbiani)

Crogioli

Regolazione biochimica della velocità di reazione

Condensati che agiscono come a sequestra il crogiolo enzimi e loro substrati di una specifica reazione biochimica, e quindi consente la reazione per procedere in modo efficiente.

Concentrazione: arricchimento di entrambi enzima e substrato in i condensati danno luogo ad un sostanziale aumento del prodotto all'interno del condensa.

Specificità: arricchimento del condensato di un solo componente risulterà maggiore attività della condensa di l'enzima ma un'attività di massa inferiore dovuta all'enzima sequestro dal suo substrato.

Esclusione: se è presente un inibitore che esclude dal condensato, insieme con la concentrazione di enzima e substrato all'interno dei condensati, questo lo farà promuovere ulteriormente la generazione di prodotti.

L'impalcatura dei componenti della reazione può ulteriormente promuovere velocità di reazione, in un meccanismo indipendente dalla concentrazione stretto legame di enzima e substrato da uno scaffold che può accelerare il reazione.

Spugne

Condensati che agiscono come una spugna sequestra fattori specifici da circostante spazio intracellulare (forma libera), risultando soppressione del funzione di questi fattori esterni al condensa.

Hub

I condensati che agiscono come un hub si associa a cromosomico multiplo loci, che consente più geni da essere regolamentato in modo coordinato da un regolamento proteine. I condensati dell’hub può influenzano anche il 3D organizzazione del genoma e nucleo.

Interfaccia dei condensati biomolecolari modulati da reazioni redox

La transizione di fase della biomacromolecole può risultare in un gradiente di densità ionico.

L’interfaccia dei condensati biomolecori possiede un potenziale elettrico.

Il campo elettrico di interfaccia può guidare reazioni redox spontanee.

Il processo di transizione della densità può stabilire un gradiente di concentrazione selettivo ioni, che è dettato dalla componente molecolare dei condensati.

LLPS e trasduzione di segnalazione

Schema dell'inizio del segnale dal recettore tirosina chinasi (RTK) (verde). Al momento del legame di fattore di crescita extracellulare (arancione), l'attività della chinasi intracellulare è sovraregolata, con conseguente fosforilazione dei residui di tirosina sul recettore (la “P” verde cerchiata). Questi post-traduzionali i residui modificati contribuiscono al reclutamento delle proteine effettrici a valle (rosse) e ad un segnale via di trasduzione attraverso successive interazioni con altre proteine (viola). Entro a goccioline (a destra, riquadro) più RTK si raggruppano sulla membrana e sono esposti a livelli elevati concentrazioni di proteine effettrici a valle per guidare la trasduzione del segnale mutuamente esclusiva iniziazione (freccia verde).

L'organizzazione della membrana plasmatica in biochimica nei compartimenti distinti svolge un ruolo importante nella trasmissione di segnali tra l'ambiente extracellulare e il citoplasma. Numerosi recettori formano oligomeri legandosi a ligandi extracellulari e questa oligomerizzazione porta alla formazione di cluster di ordine superiore. I meccanismi fisici che producono il strutture più grandi in risposta ai segnali e al funzionale le conseguenze di tali strutture sono meno ben comprese.

Condensati biomolecolari nei recettori di membrana per la segnalazione

Polimerizzazione e separazione di fase concomitante come un meccanismo generale per creare cluster di membrana.

Le code citoplasmatiche di molti recettori sono fosforilate rapidamente su più residui di tirosina dopo stimolazione da ligandi extracellulari.

Ciò accade spesso concomitante con concentrazione di recettori in punti di dimensioni micron.

Quando esaminati, questi punti persistono per molti minuti, ma scambiano molecole in pochi secondi con l'ambiente circostante.

È stato dimostrato che molti di questi recettori attivano la segnalazione reti composte da proteine con molteplici modularità domini leganti: spesso combinazione di domini SH2, domini SH3, PRM e siti pTyr aggiuntivi.

La separazione della fase proteica è un meccanismo per il raggruppamento dei recettori di membrana del plasma.

Le proteine di membrana possono separare la fase centrale componenti o clienti arricchiti

I colori dal verde al ciano indicano le proteine principali necessarie per LLPS. I colori magenta indicano le proteine cliente che si localizzano nel condensato ma non sono necessarie per LLPS.

Segnalazione dei condensati con recettori ai nuclei proteici

Meccanismi multipli guidano i raggruppamenti di recettori:

dimerizzazione
oligomerizzazione e formazione complessa
compartimentazione con nanodomini
raggruppamento mediato dal citoscheletro
LLPS di proteine al PM, dove interazioni multivalenti deboli tra proteine guidano la formazione di condensati biomolecolari

Condensazione di recettori tirosin-chinasi (RTKs)

Gli RTKs sono portati insieme come un cluster mediante interazioni con ligandi extracellulare e/o formazione di microdomini lipidici.

Questo forma interazioni multiple con molecole di segnalazione a valle che sono ad alta concentrazione dentro le gocce.

La regione terminale C consiste spesso di regioni intrinsecamente disordinate, come motivi ricchi di prolina e tirosina fosforilata. Le caratteristiche di queste strutture possono essere utilizzate per il reclutamento di proteine e sostenere la separazione di fase dei condensati.

Differenti esempi di come la separazione di fase è regolata da segnali

Gruppo 1: le proteine di segnalazione dei recettori/membrana sono una componente del nucleo richiesta per LLPS

Gruppo 2: i condensati formati da interazioni multivalenti tra proteine strutturali, che poi organizzano i recettori: i recettori sono clienti che localizzano il condensato sulla PM, ma non sono richiesti per la formazione del condensato.

Interazioni multivalenti proteina-proteina e modificazioni post traslazionali (PTMs) guidano LLPs al recettore tirosin-chinasi (RTKs) e i substrati a valle alla membrana plasmatica.

Il potenziale di separazione di fase del RTKs, le code del terminale C derivano dai software, PSPredictor and FuzDrop.

Le proteine per la separazione di fase sono proteine scaffold che organizzano i recettori al PM.

La condensazione sinaptica controlla il sequestro e la dinamica delle vescicole sinaptiche

La comunicazione neuronale crucialmente fa affidamento su l’esocitosi dei neurotrasmettitori dalle vescicole sinaptiche che sono raggruppate alle sinapsi.

Le sinapsi formano condensati come fluidi arricchiti con vescicole sinaptiche.

Aumento del tempo di permanenza dei condensati associati alla membrana

Una diminuzione del tasso che una proteina diffonde attraverso la membrana aumenta la probabilità di una reazione produttiva concedendo più tempo per lo svolgimento delle fasi intermedie.

La formazione di condensati è un processo dinamico che è regolato da parecchi fattori e richiede energia.

Le superfici di membrana, le modificazioni post-traslazionali e i processi attivi regolano le transizioni di fase.

Regolazione di condensati biomolecolari da processi attivi

Una volta che la separazione di fase avviene, le cellule devono mantenere e rimodellare i condensati biomolecolari per soddisfare requisiti cellulari specifici.

I meccanismi che consumano energia sono richiesti per mantenere la funzione e le identità dei condensati:

ATP e guasina trifosfato
GTP processi consumati

Regolazione dei condensati dai chaperoni molecolari

I chaperoni legano proteine diverse e consumano energia per rimodellare le interazioni proteina-proteina e assistono nel ripiegamento delle proteine.

I chaperoni possono reclutare all’interno dei condensati per prevenire l’aggregazione proteica.

I granuli di stress sono condensati biomolecolari ben studiato regola chaperoni molecolari.

La formazione di condensato integra l’informazione su una scala cellulare associando i cambiamenti ambientali alla transizione dai regimi monofase a quelli bifase e può mediare attivazione di risposte omeostatiche appropriate.

Le transizioni di fase sono straordinariamente sensibili a condizioni della soluzione, tra cui temperatura, pH e forza ionica.

I sistemi biologici potrebbero essersi evoluti per sfruttarli come meccanismo di percepiscono condizioni ambientali potenzialmente deleterie e inducono risposte omeostatiche appropriate.

mRNA indotto da stress condensazione e accumulo in granuli di stress (SG)

I granuli di stress sono foci citoplasmatici che si assemblano come parte del sistema cellulare. risposta allo stress. Essi derivano in gran parte dallo stallo della traduzione precedente all'inizio del processo e sono costituiti principalmente da molecole di mRNA. La maggior parte di questi sono proteine che legano l'RNA (RBP).

Diversi tipi di proteina-proteina (pp), proteina-RNA (pR), e le interazioni RNA-RNA (RR) sono implicate nell'assemblaggio delle SG.

Gli SG funzionano come depositi di RNA e proteine nelle cellule sotto stress, ma consentire mobilitazione rapida di queste molecole quando il condizioni dannose si placano.

Le SG possono modulare l’espressione di specifiche proteine durante lo stress, da dirigere un particolare mRNA specie a diverse possibili destini. Questa azione comporta uno scambio di mRNA tra gli SG e organismi di elaborazione, su aggancio di questi due tipi dei granuli di RNA.

Traduzione di alcuni proteine coinvolte nello stress le risposte possono essere priorità, alcuni mRNA possono essere conservati in SG o altrove, mentre altri possono essere mirati per degradazione da parte del organismi di elaborazione.

Intercettando segnalazione particolare molecole, gli ER possono segnalazione di attivazione cascate che regolano o modificare la crescita cellulare, sopravvivenza o metabolismo, o che promuovono apoptosi:astrino sequestra raptor all'interno di SG inibire l'apoptosi durante lo stress;

L'astrina media l'anti-SG apoptotico funzioni di prevenire mTORC1 iperattivazione.

Il corpo di Balbiani

Il corpo di Balbiani contiene una rete amiloidogenica formata dalla proteina Xvelo in X. laevis. Xvelo contiene un PrLD che è necessario per il suo auto-assemblaggio e per la sua associazione con organelli, come mitocondri.

Il disassemblaggio del Corpo di Balbiani è innescato dall'attivazione dell'ovocita.

In generale, le transizioni di fase sono dinamiche e fortemente regolamentate.

Maturazione dei condensati di un stato liquido dinamico in uno stato stato solido-aggregato è associato con perdita di funzione e/o guadagno di funzione tossica.

Due vie possono portare alla formazione di aggregati: percorso diretto di deposizione e invecchiamento del condensato.

Fibrille amiloidi

Molte proteine possono formare fibrille amiloidi: i foglietti beta possono contribuire alla formazione di aggregati stabili che si propagano e sono associati a patologie neurodegenerative.

Le strutture amilodi non sono sempre tossiche e possono avere delle funzioni biologiche.

Gli ormoni peptidici sono immagazzinati nelle cellule eucariotiche in forma di fibrille amiloidi in granuli secretori.

Una volta secreti nello spazio extracellulare le amiloidi reversibili rilasciano i peptidi solubili.

Gli ioni facilitano il processo di aggregazione reversibile.

I batteri producono e secernono proteine che formano fibrille amiloidi sulla loro superficie. Queste fibrille formano un biofilm che tiene uniti i batteri e li protegge da ambienti ostili.

Distruzione del biofilm attraverso la disaggregazione delle fibrille come nuovo approccio farmacologico.

La capacità di numerose proteine di assumere stati di folding differenti e formare “aggregati” reversibili è associata alla loro funzione biologica.

Questa enorme flessibilità le rende però più sensibili a variazioni fisico-chimiche ambientali e prone all’aggregazione irreversibile.

Ciò comporta perdita di funzione e guadagno di funzione tossica ed è associato ad invecchiamento e patologie umane.

Malattie da prioni

Si diffondono da un organismo all’altro, mangiando tessuti che contengono l’aggregato proteico.

Riassumendo:

I condensati multicomponente possono adottare una
organizzazione e mostrano architetture distinte
i condensati possono essere ubiquitari e inducibili
Funzioni dei condensati: crogioli, spugne, HUB
ruolo dei condensati in: segnalazione dei recettori di membrana
I condensati possono potenziare o sopprimere le reazioni
I condensati regolano la risposta allo stress cellulare
La formazione e la dinamica dei condensati richiedono ENERGIA
le superfici delle membrane limitano la diffusione delle proteine a due
dimensioni, riducendo le concentrazioni soglia richieste
per la separazione di fase
i processi attivi regolano i condensati: RNA elicasi e
chaperoni molecolari
I PTM regolano le transizioni di fase
invecchiamento del condensato e aggregazione proteica
amiloidi funzionali
transizione liquido-solido, invecchiamento e neurodegenerazione
condensati aberranti e cancro

DNA, cromatina ed organizzazione del genoma

Nucleosidi, nucleotidi e acidi nucleici

Nucleosidi: Un nucleoside è composto da una base azotata (come adenina, guanina, citosina o timina nell'RNA e nell'DNA) legata a uno zucchero a cinque atomi di carbonio (ribosio nell'RNA e desossiribosio nel DNA). Non contengono gruppi fosfato.
Nucleotidi: Un nucleotide è un nucleoside a cui è legato uno o più gruppi fosfato. I nucleotidi sono le unità fondamentali che costituiscono gli acidi nucleici. Essi svolgono anche ruoli importanti nel metabolismo cellulare e nella trasmissione dell'energia (ad esempio, l'ATP è un nucleotide).
Acidi nucleici: Gli acidi nucleici, come il DNA e l'RNA, sono polimeri di nucleotidi. Il DNA (acido desossiribonucleico) immagazzina l'informazione genetica, mentre l'RNA (acido ribonucleico) è coinvolto nella sintesi proteica e in altri processi cellulari.

Basi azotate

Le basi azotate sono composti chimici che costituiscono un componente fondamentale degli acidi nucleici, come il DNA e l'RNA. Esistono cinque basi azotate principali, suddivise in due categorie: basi puriniche e pirimidiniche.
Basi puriniche:

Adenina (A): Presente sia nel DNA che nell'RNA.
Guanina (G): Presente sia nel DNA che nell'RNA.

Basi pirimidiniche:

Citosina (C): Presente sia nel DNA che nell'RNA.
Timina (T): Presente solo nel DNA.
Uracile (U): Presente solo nell'RNA, sostituisce la timina.

Le basi azotate si legano tra loro attraverso legami idrogeno, formando le coppie complementari nel DNA (A con T e G con C) e nell'RNA (A con U e G con C). Queste interazioni sono fondamentali per la stabilità della struttura a doppia elica del DNA e per il funzionamento dell'RNA.

Struttura e funzione del DNA: 4 nucleotidi legati covalentemente.

I due filamenti si avvolgono l’uno sull’altro formando una doppia elica

Funzioni biologiche dei nucleotidi:

Precursori di DNA ed RNA
Donatori di energia: nucleoside trifosfati (ATP)
Componenti di coenzimi: NAD(P)+, FAD, CoA
Mediatori chimici: adenosina monofosfato ciclico (AMP ciclico o c-AMP) è un metabolita prodotto dall'ATP mediante l'enzima adenilato ciclasi che media molte risposte intracellulari

Tutte le cellule conservano la loro informazione ereditaria nello stesso codice chimico lineare : DNA

Tutte le cellule replicano la loro informazione ereditaria mediante polimerizzazione su stampo.

La duplicazione dell’informazione genetica avviene mediante replicazione del DNA.

I due filamenti si separano e ciascuno di essi serve da stampo per la sintesi del nuovo filamento secondo il modello semiconservativo.

Genoma umano

Il genoma umano è l'insieme completo del materiale genetico presente negli esseri umani. Esso contiene tutte le informazioni necessarie per lo sviluppo, il funzionamento e la riproduzione dell'organismo.

Il contenuto del genoma umano sequenziato è:

LINE: long interspersed nuclear elements (lunghi elementi sparsi)
SINE: short interspersed nuclear elements (brevi elementi sparsi)
Elementi simili a retrovirus
Trasposoni: elementi genetici mobili (si sono moltiplicati inserendo nuove copie nel genoma)
Sequenze ripetute

La maggior parte del DNA umano non codifica per proteine.

Cromosomi

Nelle cellule eucariotiche il DNA si trova nel nucleo ed è compattato in fibre di cromatina.

Il DNA eucariotico è compattato in cromosomi.

I cromosomi sono strutture filamentose presenti nel nucleo delle cellule eucariotiche, composti da DNA e proteine. Essi svolgono un ruolo cruciale nella conservazione e nella trasmissione dell'informazione genetica durante la divisione cellulare. Ecco alcune informazioni chiave sui cromosomi:
- Struttura: ogni cromosoma è costituito da una lunga molecola di DNA avvolta attorno a proteine chiamate istoni, che aiutano a compattare il DNA in una forma più gestibile. I cromosomi sono visibili al microscopio durante la fase di divisione cellulare (mitosi e meiosi).
- Numero di cromosomi: negli esseri umani, ci sono 46 cromosomi, organizzati in 23 coppie. Ogni coppia è composta da un cromosoma ereditato dalla madre e uno dal padre. Le prime 22 coppie sono chiamate cromosomi autosomici, mentre la 23ª coppia è rappresentata dai cromosomi sessuali (XX nelle femmine e XY nei maschi).
- Funzione: i cromosomi contengono i geni, che sono le unità di informazione genetica. Durante la divisione cellulare, i cromosomi si duplicano e si distribuiscono alle cellule figlie, garantendo che ciascuna cellula riceva una copia completa del materiale genetico.
- Anomalie cromosomiche: alterazioni nel numero o nella struttura dei cromosomi possono portare a condizioni genetiche o malattie.

La composizione di un cromosoma è data principalmente da:
- DNA: La parte principale di un cromosoma è costituita da una lunga molecola di DNA. Questa molecola è composta da una sequenza di nucleotidi, ognuno dei quali è formato da una base azotata (adenina, guanina, citosina o timina), uno zucchero (desossiribosio) e un gruppo fosfato. Il DNA contiene le informazioni genetiche necessarie per lo sviluppo e il funzionamento dell'organismo.
- Proteine: I cromosomi contengono anche proteine, in particolare gli istoni, che sono proteine basiche che aiutano a impacchettare il DNA. Gli istoni formano strutture chiamate nucleosomi, che consistono in un segmento di DNA avvolto attorno a un ottamero di istoni. Questo impacchettamento consente al DNA di occupare meno spazio e di essere organizzato in una forma compatta.
- Centromero: Ogni cromosoma ha una regione chiamata centromero, che è il punto di attacco per le fibre del fuso durante la divisione cellulare. Il centromero divide il cromosoma in due bracci: il braccio corto (p) e il braccio lungo (q).
- Telomeri: Le estremità di ogni cromosoma sono protette da sequenze di DNA chiamate telomeri. I telomeri svolgono un ruolo importante nella protezione del DNA da danni e nel mantenimento della stabilità cromosomica. Si accorciano ad ogni divisione cellulare, e la loro lunghezza è associata all'invecchiamento cellulare.
- Sequenze non codificanti: Oltre ai geni, i cromosomi contengono anche sequenze di DNA non codificanti, che possono avere ruoli regolatori o strutturali, ma non codificano direttamente per le proteine.

Ciascun cromosoma contiene: 2 telomeri, 1 centromero e varie origini di replicazione

Il centromero interagisce con il fuso mitotico e permette a ciascuna copia del cromosoma duplicato di essere trasportata ai poli opposti della cellula in divisione.

Le molecole di DNA nei cromosomi sono altamente condensate: associazione con proteine istoniche, nucleosomi e cromatina.

I diversi livelli di compattamento della cromatina sono:

DNA+nucleosomi: perline sul filo
Fibra cromatinica di 30 nm
Ripiegamento a formare le anse cromatiniche
Cromosoma altamente condensato (visibile solo durante la mitosi)

I nucleosomi sono molto dinamici e si rimodellano.

Ai nucleosomi possono associarsi i complessi di rimodellamento della cromatina, che legano sia i nucleosomi che il DNA.

I complessi di rimodellamento della cromatina ATP-dipendenti rendono il DNA accessibile.

Le fasi del rimodellamento sono:

1) L’idrolisi dell’ATP mediata dai complessi di rimodellamento della cromatina spinge sul DNA e ne allenta l’attacco.

2) Il nucleosoma scorre ed il DNA viene spostato.

Molteplici cicli di idrolisi di ATP spostano il DNA e lo rendono accessibile ad altre proteine.

La cooperazione dei complessi di rimodellamento con chaperoni degli istoni permette di rimuovere dimeri H2A-H2B da un nucleosoma e sostituirli o rimuovere completamente l’ottamero istonico.

Varianti istoniche

Le varianti istoniche conferiscono proprietà strutturali specifiche a sequenze di DNA alterando la stabilità dei nucleosomi.

Le varianti istoniche sono riconosciute da specifiche proteine.

È il reclutamento specifico di questi complessi proteici che permette di regolare finemente se e come queste regioni di DNA saranno trascritte o silenziate.

Posizionamento dei nucleosomi: i nucleosomi interagiscono con il DNA in modo dinamico ed indipendentemente dalla sequenza del DNA.

I nucleosomi non sono fissi e possono essere posizionati in zone specifiche. Ciò è generalmente diretto da proteine specifiche che legano particolari regioni e sequenze di DNA.

I nucleosomi si impilano e formano la fibra cromatinica di 30 nm

Le code flessibili degli istoni favoriscono il compattamento.

Anche l’istone linker H1 contribuisce al compattamento della cromatina.

Eterocromatina e eucromatina

Eucromatina: È la forma meno condensata della cromatina ed è associata a regioni del DNA che vengono attivamente trascritte in RNA. L'eucromatina è ricca di geni e, essendo più accessibile, consente alle enzimi di trascrizione di accedere al DNA e avviare la sintesi delle proteine.
Eterocromatina: È la forma più condensata della cromatina e di solito è associata a regioni del DNA che non vengono trascritte. L'eterocromatina può essere suddivisa in due tipi: eterocromatina costitutiva, che è sempre compatta e non viene trascritta, ed eterocromatina facoltativa, che può diventare eucromatina in determinate condizioni.

Il 10% del DNA è in forma di eterocromatina e contiene pochi geni.

La conversione di regioni di eucromatina in eterocromatina porta allo spegnimento dell’espressione dei suoi geni.

Il nucleo interfasico è eterogeneo con regioni “attive” e regioni “inattive”

L’eterocromatina e l’eucromatina sono coinvolte nell’espressione genica, mediante le modificazioni post-traduzionali degli istoni: acetilazione, mono-, di- e tri-metilazione di K e fosforilazione di S

Acetilazione e metilazione competono fra loro e modificano l’affinità di legame al DNA (carico negativamente)

acetilazione: rimuove una carica + e riduce l’interazione con DNA
metilazione: può ridurre l’accessibilità al DNA

Dove gli istoni e il DNA sono fermamente legati insieme, l’RNA polimerasi ha difficoltà nel legare il DNA e sintetizzare RNA.

Uno dei ruoli dei potenziatori è quello di allentare la legame tra gli istoni e il DNA e a volte rompono il nucleosoma per promuovere la struttura dell'RNA sintesi da parte della RNA polimerasi. Questo fenomeno è chiamato cromatina rimodellamento perché cambia il struttura del nucleosoma.

Gli istoni acetilati sono associati a geni altamente trascritti.

La proteina HP1 è un repressore trascrizionale che lega direttamente i residui di lisina 9 metilati dell’istone 3 (H3K9me). Essa forma un dimero simmetrico e collega due nucleosomi H3K9me3 nel complesso.

Queste interazioni influenzare il silenziamento genico in parte escludendo l'accesso a la trascrizione macchinari.

HP1α e DNA si raggruppano in proto-condensati. Se HP1α è presente sopra la concentrazione critica, i proto-condensati si aggregano in grandi gocce macroscopiche caratterizzate da comportamento liquido di HP1α e statico DNA trattenuto in domini subcondensati.

Quando due condensati si fondono, le molecole di HP1α si scambiano rapidamente tra le due mentre il DNA di ciascun condensato rimane intrappolato in territori separati.

Metilazione del DNA

La metilazione del DNA su citosine contribuisce ad inibire l’espressione genica ed è ereditata fedelmente. Molte sequenze CG sono metilate da metiltrasferasi di mantenimento.

Le nuove metilazioni operate da DNA metiltrasferasi de novo sono propagate attraverso cicli di replicazione di DNA da parte delle DNA metiltrasferasi di mantenimento.

Entrambi i DNA demetilati e metilati giocano ruoli importanti nel differenziamento e nello sviluppo del mammifero.

Nei mammiferi, la metilazione si trova in modo sparso ma globalmente, distribuita in sequenze definite CpG (C-phosato-G) attraverso l’intero genoma. Molti nucleotidi CpG sono metilati, con l’eccezione di queste all’interno delle isole CpG, che sono generalmente non metilate. I nucleotidi metilati sono spesso associati con il silenziamento genico.

Cosa definisce il limite tra eterocromatina ed eucromatina?

Le sequenze di DNA barriera, esse infatti separano i domini adiacenti di cromatina e impediscono la diffusione dell’eterocromatia.

A: la proteina barriera lega il DNA ed il complesso del poro nucleare

B: la proteina barriera lega il DNA ed un gruppo di nucleosomi

C: la proteina barriera recluta enzimi che acetilano gli istoni (H3K9) ed impediscono il legame di HP1 necessario per produrre eterocromatina

Il grado di compattamento della cromatina è ereditato dalle cellule figlie

I territori/regioni cromosomici

Ogni cromosoma occupa un microterritorio distinto: non sono aggrovigliati insieme

I cromosomi sono ripiegati in una conformazione specifica: modello a globulo frattale senza nodi.

La maggior parte dei cromosomi sono ripiegati in un globulo frattale, una disposizione senza nodi molto densa e compatta che preserva la capacità della cromatina di dipanarsi.

Il globulo frattale è una disposizione senza nodi molto densa e compatta che preserva la capacità della cromatina di dipanarsi.

Il globulo di equilibrio ripiega il DNA ma introduce grovigli e nodi, rendendo difficile per il DNA dispiegarsi e si ripiegano durante la replicazione.

Le regioni cromosomiche non occupano posizione fisse ma si spostano nel nucleo.

Trascrizione

Tutte le cellule trascrivono parte della loro informazione ereditaria nella stessa forma intermedia: RNA.

L’RNA è a singolo filamento e contiene lo zucchero RIBOSIO (con un gruppo –OH in più rispetto al deossiribosio).

L’RNA contiene l’uracile invece della timina.

L’RNA si ripiega e forma strutture complesse specifiche.

Tutto l’RNA è prodotto dalla trascrizione del DNA.

La trascrizione è una polimerizzazione su stampo in cui segmenti del DNA sono usati per guidare la sintesi di RNA.

Da un unico frammento di DNA vengono sintetizzate numerose molecole identiche di RNA.

La trascrizione è eseguita dalla RNA polimerasi, si muove lungo il filamento stampo verso la sua estremità 5’ (si muove in direzione 3’ - 5’) ed assembla un filamento complementare di RNA, che cresce dal suo terminale 5’ in direzione 3’.

Al suo passaggio, l’RNA polimerasi SROTOLA il DNA.

L’RNA polimerasi copre circa 35 paia di basi.

La bolla di trascrizione composta da DNA a singolo filamento contiene circa 15 paia di basi. Il segmento presente come ibrido DNA-RNA include 9 paia di basi.

“Attività di correttore di bozze” o proofreading: l’RNA polimerasi è in grado di riconoscere e rimuovere un nucleotide erroneamente incorporato.

Le RNA polimerasi possono arrestarsi, o muoversi all’indietro.

La funzione correttiva è svolta dallo stesso sito attivo dell’enzima che è responsabile dell’incorporazione dei nucleotidi.

La trascrizione procede da sx a dx generando molecole di RNA progressivamente più lunghe.

Ci sono tre tipologie di DNA polimerasi: la I, la II e la III.

La trascrizione richiede il PIC.

Il complesso di pre-inizio (PIC) è composto da diverse proteine e fattori che collaborano per avviare la trascrizione del DNA. I principali componenti del PIC includono:

RNA Polimerasi II: È l'enzima responsabile della sintesi dell'RNA messaggero (mRNA) a partire dal DNA.
Fattori di trascrizione (TFs): Questi sono proteine che si legano al promotore del gene e sono essenziali per il corretto assemblaggio del PIC. Tra i più importanti ci sono:
TFIID: Contiene la subunità TATA-binding protein (TBP), che si lega alla sequenza TATA del promotore.
TFIIB: Aiuta a posizionare RNA polimerasi II sul promotore.
TFIIF: Stabilizza il legame tra RNA polimerasi II e TFIIB.
TFIIE: Recluta il fattore TFIIH, che ha un ruolo nella regolazione della trascrizione.
TFIIH: Ha attività di elicasi e chinasi, essenziale per l'apertura del DNA e la fosforilazione della RNA polimerasi II.
Fattori di regolazione: Oltre ai fattori di trascrizione generali, ci sono anche fattori di regolazione specifici che possono influenzare l'assemblaggio del PIC e la sua attività, modulando l'espressione genica in risposta a segnali cellulari.
Coattivatori e corepressori: Questi sono complessi proteici che interagiscono con i fattori di trascrizione per aumentare (coattivatori) o diminuire (corepressori) l'attività trascrizionale.

I Tfs possono essere guidati da LLPS, essi subiscono LLPS da loro stessi.

I Tfs possono essere clienti: il TF è incorporato nei condensati attivatori attraverso l’interazione con i co-attivatori.

I Tfs consistono in un dominio di DNA legato e un dominio di attivazione (AD)

La BRE, o "B Recognition Element," è una sequenza di DNA che funge da sito di riconoscimento per il fattore di trascrizione TFIIB, che è uno dei fattori di trascrizione generali coinvolti nella formazione del complesso di pre-inizio (PIC) per la trascrizione mediata da RNA polimerasi II. Ecco alcuni punti chiave sulla BRE:

Posizione: La BRE si trova generalmente a monte del sito di inizio della trascrizione, vicino al promotore del gene. È una delle sequenze che contribuiscono alla corretta localizzazione e assemblaggio del PIC.
Funzione: La BRE è importante per il legame di TFIIB al DNA. Questo legame è fondamentale per il reclutamento di RNA polimerasi II e per l'inizio della trascrizione. TFIIB stabilizza l'interazione tra il promotore e l'enzima, facilitando il processo di trascrizione.

La maggior parte dei promotori contiene la TATA box

La TATA box è una sequenza di DNA presente nei promotori di molti geni e gioca un ruolo cruciale nell'inizio della trascrizione. Ecco alcune informazioni chiave sulla TATA box:

Funzione: La TATA box è riconosciuta dalla subunità TATA-binding protein (TBP), che è parte del complesso TFIID. Quando TBP si lega alla TATA box, induce una curvatura nel DNA, facilitando il reclutamento di altri fattori di trascrizione e dell'RNA polimerasi II, essenziali per la formazione del complesso di pre-inizio (PIC).
Importanza nella trascrizione: La presenza di una TATA box ben definita è spesso associata a un'attivazione trascrizionale efficiente. Tuttavia, non tutti i geni contengono una TATA box; alcuni promotori possono avere altre sequenze di riconoscimento o elementi regolatori.

Inizio della trascrizione

Attivatori e modificatori della cromatina sono necessari affinchè la trascrizione sia attivata: il complesso proteico mediatore.

Il complesso proteico mediatore è fondamentale nella regolazione della trascrizione genica. Questo complesso agisce come un intermediario tra i fattori di trascrizione e l'enzima RNA polimerasi, facilitando l'inizio e la regolazione della sintesi dell'RNA a partire dal DNA.
Funzioni del complesso proteico mediatore nella trascrizione:

Interazione con i fattori di trascrizione: Il mediatore si lega ai fattori di trascrizione che riconoscono specifiche sequenze nel promotore del gene, contribuendo a reclutare l'RNA polimerasi.
Trasmissione di segnali: Il complesso mediatore riceve segnali da altre proteine e molecole, che possono attivare o inibire la trascrizione di un gene in risposta a cambiamenti ambientali o segnali cellulari.
Regolazione dell'attività dell'RNA polimerasi: Una volta che il mediatore è legato al complesso di pre-inizio della trascrizione, facilita l'assemblaggio dell'RNA polimerasi sul DNA, promuovendo l'inizio della sintesi dell'RNA.

Mediatore ed il complesso CDK–Mediatore:

-indica all’RNA Pol II dove iniziare la trascrizione (attivatore)

- regola la fase di allungamento della trascrizione

Il mediatore e il TFIID lavorano insieme per organizzare il PIC sul DNA promotore

Nota bene: Il mediatore è necessario per l'attivazione della trascrizione da parte di ma NON interagisce tipicamente con l’allungamento della RNA polimerasi II.

ALLUNGAMENTO della trascrizione, fattori di allungamento & fosforilazione della coda carbossi-terminale di RNA pol II

L’evasione del promotore richiede la fosforilazione della coda della RNA Pol II.

Negli eucarioti la RNA pol II interagisce con proteine di modificazione del pre-mRNA: fosforilazione della coda carbossi terminale.

I livelli di RNA determinano la dissoluzione dei condensati trascrizionali, nello specifico bassi livelli permettono la dissoluzione mentre alti livelli permettono la formazione.

Nelle cellule eucariotiche, l’allungamento della trascrizione (sintesi di RNA precursore) è accoppiato alla maturazione dell’RNA.

L’mRNA maturo contiene il cappuccio 5’ e la coda di poli-A.

Negli eucarioti la RNA pol II interagisce con proteine di modificazione del pre-mRNA

1) Le proteine che aggiungono il cappuccio 5’ interagiscono con Ser5 fosforilata, garantendo che il cappuccio sia aggiunto non appena l’estremità 5’ emerge dalla RNA pol II

2) Durante la fase di allungamento la Ser5 è defosforilata ed una chinasi fosforila la Ser2: ciò permette il reclutamento delle proteine di splicing

Splicing

Lo splicing è un processo fondamentale nella maturazione dell'RNA messaggero (mRNA) e consiste nell'eliminazione degli introni (sequenze non codificanti) e nell'unione degli esoni (sequenze codificanti) per formare un mRNA maturo pronto per la traduzione in proteine. Questo processo avviene nel nucleo delle cellule e coinvolge diversi passaggi chiave.
Fasi del processo di splicing:

Riconoscimento dei siti di splicing: Il pre-mRNA contiene segnali specifici che indicano dove gli introni e gli esoni si trovano. Le sequenze di riconoscimento sono cruciali per il corretto svolgimento del processo.
Formazione del complesso di spliceosoma: Il processo di splicing è mediato dallo spliceosoma, un complesso macromolecolare che include piccole ribonucleoproteine nucleari (snRNPs) e proteine associate. Questi componenti si legano al pre-mRNA nei punti di splicing. Un residuo di adenina si attacca al sito di splicing 5’ e taglia l’RNA in quel punto creando un’ansa. L’estremità 3’-OH libera reagisce con l’inizio dell’esone successivo unendo i due esoni. La sequenza intronica a cappio viene rilasciata per poi essere degradata in singoli nucleotidi che saranno riciclati.
Taglio degli introni: Lo spliceosoma catalizza due reazioni di taglio che rimuovono gli introni. Durante la prima reazione, viene formato un intermediario a forma di lasso, noto come "lasso intronico".
Unione degli esoni: Dopo il taglio degli introni, gli esoni vengono uniti insieme per formare un mRNA continuo e maturo.
Esportazione del mRNA maturo: Una volta completato lo splicing, l'mRNA maturo viene esportato dal nucleo al citoplasma, dove sarà tradotto in proteine.

Spliceosoma

Lo spliceosoma è un complesso macromolecolare altamente dinamico e complesso che svolge un ruolo cruciale nel processo di splicing dell'RNA. Questo processo è essenziale per la maturazione dell'RNA messaggero (mRNA) e consiste nell'eliminazione degli introni (le sequenze non codificanti) e nell'unione degli esoni (le sequenze codificanti) per formare un mRNA maturo pronto per la traduzione in proteine. Componenti e funzionamento dello spliceosoma:

Ribonucleoproteine (snRNPs): Lo spliceosoma è composto principalmente da piccole ribonucleoproteine nucleari (snRNPs), che includono U1, U2, U4, U5 e U6. Ognuna di queste snRNP ha un ruolo specifico nel riconoscimento dei siti di splicing e nella catalisi della reazione di splicing.
Sequenze di riconoscimento: Le snRNPs si legano a sequenze specifiche nei confini degli introni ed esoni, riconoscendo i segnali di splicing.
Formazione del complesso di splicing: Il complesso di spliceosoma si assemblea attorno al pre-mRNA e catalizza le reazioni necessarie per rimuovere gli introni e unire gli esoni.
Rimozione degli introni: Durante il processo di splicing, gli introni vengono rimossi attraverso una serie di reazioni chimiche, formando un intermediario chiamato lasso e successivamente rilasciando l'introne come un lasso circolare.
Maturazione dell'mRNA: Dopo lo splicing, il mRNA maturo viene esportato dal nucleo al citoplasma per la traduzione in proteine.

Lo spliceosoma usa l’idrolisi di ATP per produrre una serie di riarrangiamenti RNA-RNA. In questa fase:

snRNP U1 si appaia al sito di splicing 5’
le coppie di basi vengono rotte man mano che procede lo splicing
U1 è poi rimapiazzata da U6

Questi riarrangiamenti avvengono ripetutamente e permettono allo spliceosoma di verificare i segnali di splicing più volte aumentando l’accuratezza dello splicing.

I riarrangiamenti generano i siti attivi per le 2 reazioni di transesterificazione.

Componenti dettagliate dello spliceosoma

Le componenti dello spliceosoma sono le small nuclear ribonucleoprotein particles: snRNP.

La snRNP U1 si appaia con la giunzione di splicing 5’.

Il fattore ausiliario di U2 (U2AF) riconosce il punto di ramificazione e la proteina BBP lega l’adenina del punto di ramificazione. La snRNP U2 si appaia con la sequenza consenso del punto di ramificazione.

La tripla snRNP U4/U6-U5 induce il rilascio di U1 rendendo possibile la reazione fosforiltrasferasica.

I riarrangiamenti RNA-RNA creano il sito attivo per la seconda reazione di fosforil-trasferasi che completa lo splicing. Ma le proteine del complesso di giunzione dell’esone rimangono associate all’esone.

Errori di splicing

Ci possono essere due tipi di errori di splicing:

salto di esone
selezione di un sito criptico di splicing

Ci sono due meccanismi per evitare gli errori di splicing:

lo splicing avviene mentre l’RNA pol II trascrive il pre-mRNA, le proteine di splicing vengono trasferite dalla coda C-terminale al sito di splicing 5’ per poi interagire col sito di splicing 3’. Il sito di splicing corretto è riconosciuto PRIMA che gli altri siti competitori a valle siano trascritti.
Legame delle proteine SR (con ripetizioni di serina e arginina) SR si legano alle sequenze ENHANCER DI SPLICING ESONICI situate negli esoni in vicinanza dei siti di splicing.

La maturazione dell'mRNA avviene in specifici condensati, le macchioline nucleari

Gli speckles sono strutture subnucleari dinamiche che contengono l'RNA pre-messaggero, fattori di splicing e altre proteine che sono coinvolte nella trascrizione,

Le macchioline contengono poco o niente DNA e non sono i principali siti di trascrizione. Funzionano invece come siti di assemblaggio/modifica che possono fornire un'attiva fattori di splicing ai siti di trascrizione.

Le macchioline nucleari sono composte da un nucleo proteico circondato da un guscio ricco di RNA.

I loci cromosomici specifici sono associati al guscio, dove si verificano lo splicing del pre-mRNA e la trascrizione.

Splicing alternativo

Lo splicing alternativo è un processo attraverso il quale un singolo gene può dare origine a diverse varianti di RNA messaggero (mRNA) mediante la combinazione di esoni in modi differenti. Questo meccanismo consente a un gene di codificare più proteine, aumentando così la diversità proteica all'interno di un organismo. Il risultato è che le cellule possono produrre proteine con funzioni diverse a partire dallo stesso gene. Tipi di splicing alternativo:

Esclusione di esoni: Alcuni esoni possono essere esclusi dal mRNA maturo, portando alla produzione di una proteina che non include quelle sequenze specifiche.
Inclusione di esoni: In alcuni casi, esoni che normalmente non vengono inclusi nel mRNA possono essere aggiunti, creando varianti proteiche con sequenze aggiuntive.
Utilizzo di siti di splicing alternativi: Possono essere utilizzati diversi siti di inizio o fine degli esoni, portando a mRNA con lunghezze e sequenze diverse.

Importanza dello splicing alternativo:

Diversità funzionale: Lo splicing alternativo permette a un organismo di adattarsi a diverse condizioni ambientali e di sviluppare una varietà di funzioni cellulari.
Regolazione genica: Questo processo consente anche una regolazione fine dell'espressione genica, in quanto le diverse varianti di mRNA possono essere prodotte in risposta a segnali specifici.
Ruolo in malattie: Alterazioni nel meccanismo di splicing alternativo sono state associate a diverse malattie, comprese alcune forme di cancro e disturbi genetici

Regolazione positiva dello splicing alternativo

Una proteina regolatrice aiuta a dirigere il macchinario di splicing verso un sito di splicing che altrimenti verrebbe saltato.

Una proteina funge da repressore legando sequenze specifiche ed impedendo l’accesso del macchinario di splicing ai siti specifici.

Terminazione della trascrizione e coda di Poli-A

CstF (fattore di stimolazione del taglio F) e CPSF (fattore di specificità del taglio e della poliadenilazione) interagiscono con la coda CTD fosforilata dell’RNA pol II e riconoscono sequenze conservate.

L’RNA è tagliato e l’enzima poli-A polimerasi (PAP).

La poli-A polimersi NON richiede un filamento stampo! Quindi la coda di poli-A NON è codificata nel genoma.

Proteine specifiche legano la coda di poli-A e ne determinano la lunghezza finale.

La polimerasi Poly(A) utilizza ATP come substrato per la creazione di un modello indipendente aggiunta di adenosina monofosfato.

L’RNA pol II continua a trascrivere RNA per centinaia di nucleotidi: però siccome questo RNA è privo del cappuccio 5’ viene degradato da un’esonucleasi 5’-3’ legata alla coda dell’RNA pol II.

Meccanismi di regolazione dei fattori di trascrizione

A: il fattore di regolazione è sintetizzato solo quando necessario ed è subito degradato.

B: L’interazione di un ligando con la proteina regolatrice ne determina l’attivazione.

C: Modificazioni post-traduzionali della proteina regolatrice la attivano

D: Formazione di un complesso fra una proteina che lega il DNA e la proteina regolatrice che attiverà la trascrizione.

E: fosforilazione di una proteina inibitoria che determina il distacco e lo smascheramento del fattore di trascrizione.

F: dissociazione nel citoplasma da una proteina inibitoria e traslocazione nel nucleo del fattore di trascrizione.

G: taglio proteolitico di una proteina integrale di membrana con rilascio di regolatore trascrizionale attivo che traslocherà nel nucleo.

RNA polimerasi

1- RNA polimerasi I: sintetizza RNA ribosomali (rRNA) più grandi

2- RNA polimerasi II: sintetizza mRNA, la maggior parte dei piccoli RNA nucleari (snRNA e snoRNA), la maggior parte dei microRNA, RNA della telomerasi.

3- RNA polimerasi III: sintetizza vari piccoli RNA fra cui tRNA, rRNA 5S e snRNA U6.

RNA pol I e III riconoscono promotori distinti ed utilizzano diversi gruppi di fattori di trascrizione: TBP è universale.

Assemblaggio del complesso di pre-inizio dell’RNA polimerasi I a livello del gene per RNA ribosomale (rDNA).

I complessi di pre-inizio dell’RNA polimerasi III differiscono in base al tipo di gene trascritto: geni per transfer RNA (tDNA); gene per 5S rRNA; gene per U6 snRNA.

I promotori della RNA pol III sono spesso situati a valle del sito di inizio della trascrizione: promotori interni.

Trascrizione di RNA messaggero da parte di RNA polimerasi II e maturazione mediante splicing di mRNA.

RNA polimerasi I e III sintetizzano: RNA ribosomale, RNA transfer ed RNA non-codificanti.

Geni di RNA non codificanti (ncRNA) possono essere trascritti dalla RNA polimerasi I, II o III, dipende dal ncRNA.

Nella maggior parte dei geni, il promotore si trova a monte del sito di inizio della trascrizione.

RNA pol I e III riconoscono promotori distinti ed utilizzano diversi gruppi di fattori di trascrizione: TBP è universale.

Assemblaggio del complesso di pre-inizio dell’RNA polimerasi I a livello del gene per RNA ribosomale (rDNA).

I complessi di pre-inizio dell’RNA polimerasi III differiscono in base al tipo di gene trascritto: geni per transfer RNA (tDNA); gene per 5S rRNA; gene per U6 snRNA.

I promotori della RNA pol III sono spesso situati a valle del sito di inizio della trascrizione: promotori interni.

Trascrizione di RNA ribosomiale e RNA non-codificanti

Sintesi degli RNA ribosomiali (rRNA)

Ribosomi = complessi macromolecolari responsabili della sintesi proteica. Sono composti da molecole di rRNA e proteine ribosomiali.

Il nucleolo è la fabbrica che produce i ribosomi.

Le subunità ribosomali conferiscono al nucleolo un aspetto granulare.

All’interno ci sono una o più zone rotondeggianti composte da materiale fibrillare (fc)

Centri fibrillari (fc): contengono il DNA che codifica per l’RNA ribosomale.

Essi sono circondati da una componente fibrillare più densa (dfc) che contiene i trascritti nascenti pre-rRNA e le proteine associate.

La trascrizione del pre-rRNA avviene al confine fra fc e dfc.

Il genoma umano contiene 5 raggruppamenti di rDNA, ognuno localizzato su un cromosoma diverso. Questi rDNA sono raggruppati in strutture nucleari irregolari: nucleolar organizer regions (NOR).

Le sequenze di DNA che codificano l’rRNA (rDNA) sono ripetute centinaia di volte.

Unità trascrizionale per rRNA

La lunghezza delle fibrille aumenta gradualmente da una estremità del DNA all’altra. Le fibrille più corte sono RNA con meno nucleotidi situati più vicino al sito d’inizio della trascrizione. Il DNA tra le fibrille più corte e quelle più lunghe corrisponde ad una unità trascrizionale. La regione di DNA tra unità di trascrizione e priva di catene di RNA, è detta spaziatore non trascritto.

Maturazione dell’rRNA precursore

In modo analogo al processo di splicing, complessi di RNA e proteine guidano l’enzima responsabile della modificazione a carico dell’RNA. Questi complessi contengono sequenze di RNA COMPLEMENTARI a quella dell’RNA messaggero prematuro (per splicing di mRNA) o del precursore dell’RNA ribosomale.

Le snRNP U1 ed U6 contengono sequenze di RNA COMPLEMENTARI a quella dell’RNA prematuro.

RNA guida si posizionano mediante appaiamento di basi sul precursore 45S per guidare la posizione esatta delle modificazioni chimiche: piccoli RNA nucleolari (snoRNA).

Ciascuno snoRNA si lega ad una porzione specifica del pre-rRNA per formare un duplex RNA-RNA.

Lo snoRNA legato guida un enzima, una metilasi o pseudouridilasi, all’interno della snoRNP, in modo da modificare uno specifico nucleotide nel pre-rRNA.

Molti snoRNA sono codificati negli introni di altri geni (spesso geni per proteine ribosomali) e sono sintetizzati da pol II.

Tutti i nucleotidi modificati del pre-rRNA restano come parti del prodotto finale, mentre le regioni non modificate sono scartate nel corso della maturazione.

La funzione dei gruppi metilici e delle pseudouridine non è chiara.

4 possibili funzioni:

1- proteggere regioni del pre-rRNA dal taglio enzimatico;

2- favorire l’avvolgimento dell’rRNA nelle strutture tridimensionali definitive;

3- favorire le interazioni dell’rRNA con altre molecole;

4- alterare leggermente la funzione dei ribosomi.

Il nucleolo è la fabbrica che produce i ribosomi (ma non solo), le sue principali funzioni sono:

1) Trascrizione e maturazione di 45S per generare 18S,5.8S e 28S rRNA;

2) Assemblaggio di ribosomi con proteine ribosomali e 5S (subunità Maggiore e minore);

3) Modificazione chimica di snRNA U6 (componente di snRNP U6 che interviene nello splicing del pre-mRNA) da parte di una snoRNA;

4) Modificazione di tRNA (i geni dei tRNA sono raggruppati nel nucleolo come i geni per rRNA);

5) Assemblaggio di complessi RNA-proteine

RNA trasfer (tRNA)

Il tRNA, o RNA di trasferimento, è un tipo di molecola di RNA che svolge un ruolo cruciale nel processo di traduzione, durante il quale le proteine vengono sintetizzate a partire da aminoacidi in base alle informazioni codificate nell'mRNA (RNA messaggero). Ogni molecola di tRNA trasporta un aminoacido specifico e presenta una regione anticodone che si accoppia con il corrispondente codone sulla catena di mRNA durante la sintesi proteica. Esso ha una struttura a trifoglio.

I tRNA sono trascritti dalla RNA polimerasi III e la sequenza promotrice è presente all’interno della parte codificante del gene.

I tRNA sono sintetizzati da geni che si trovano in piccoli gruppi (cluster) sparsi nel genoma.

Un singolo cluster contiene copie multiple di differenti geni per i tRNA e viceversa, la sequenza di DNA che codifica un dato tRNA si trova in più di un cluster.

Il DNA all’interno di un cluster (tDNA) è composto in gran parte da sequenze spaziatrici che non vengono trascritte, mentre le sequenze codificanti per i tRNA sono situate ad intervalli irregolari in ripetizione a tandem.

Il processo di maturazione del tRNA prevede anche la modificazione di svariate basi.

Sintesi proteica o traduzione

La sequenza dell’mRNA è decodificata in triplette nucleotidiche che corrispondono ad un aminoacido.

Ogni tRNA lega un aminoacido ed il suo anticodone si appaia con il codone sull’mRNA.

Le due subunità, maggiore e minore, dei ribosomi si assemblano e man mano che l’mRNA scorre sintetizzano la corrispondete catena polipepditica. Il ribosoma ha diversi siti:

sito A = sito di arrivo dell’aminoacido + tRNA
sito P = sito di allungamento della catena polipeptidica
sito E = sito di uscita del tRNA scarico

La traduzione di un mRNA comincia con il codone AUG. La subunità ribosomale minore si muove e cerca l’AUG.

Il tRNA con anticodone AUG porta SEMPRE l’aminoacido METIONINA ed è detto tRNA INIZIATORE. Vengono poi reclutati i fattori di inizio della traduzione (eIF).Poi si lega la subunità ribosomale maggiore.

Poi si lega la subunità ribosomale maggiore.

La sintesi procede fino all’arrivo del codone di STOP, che segna la fine del processo e porta al distacco dei ribosomi dall’mRNA ed al rilascio della proteina di nuova sintesi.

Le proteine sono sintetizzate sui POLIRIBOSOMI: numerosi ribosomi leggono simultaneamente lo stesso mRNA.

RNA non-codificanti (ncRNA)

ncRNAs sono trascritti di RNA che non codificano per proteine:

- Piccoli RNA non codificanti (siRNA, miRNA, piRNA)

- Lunghi RNA non codificanti

RNA interferenti

Gli RNA interferenti sono RNA che bloccano la produzione di una proteina bersaglio (GTP). Essi sono:

RNA senso = RNA con la stessa sequenza dell’mRNA
RNA antisenso = RNA con sequenza complementare a quella dell’mRNA
RNA a doppio filamento (dsRNA) = RNA contenente entrambe le sequenze senso e antisenso, legate tra di loro.

Il dsRNA bloccò la produzione della proteina bersaglio, da qui l’interferenza dell’RNA (RNA interference, RNAi). Nello specifico:

1. dsRNA viene tagliato in frammenti più piccoli a doppio filamento, chiamati siRNA ad opera della ribonucleasi Dicer

2. Vengono generati siRNA con estremità 3 sporgenti

3. Il siRNA si associa al complesso proteico pre-RISC che contiene la proteina Argonauta (tipicamente Ago2)

4. Aroganuta taglia e rimuove uno dei filamenti dell’RNA duplex (noto come il filamento passeggero). Il filamento passeggero si dissocia dal pre-RISC.

5. il filamento guida viene incorporato in un complesso proteico denominato RNA-induced silencing complex (RISC) che permette ai siRNA di legarsi ad un RNA con sequenza complementare bersaglio.

6. L’RNA bersaglio viene tagliato dall’attività ribonucleasi di Ago2 a livello di un sito specifico

I microRNA (miRNA) e siRNA

Sia le piante che gli animali producono centinaia di piccolissimi RNA, detti microRNA (miRNA). I miRNA sono molto specifici e vengono sintetizzati soltanto in determinati momenti dello sviluppo o in determinati tessuti.

Il siRNA, o RNA interferente piccolo, è una molecola di RNA a doppio filamento che gioca un ruolo fondamentale nei processi di silenziamento genico e regolazione dell'espressione genica. È coinvolto in meccanismi cellulari chiamati RNA interference (RNAi), che possono ridurre o bloccare l'espressione di geni specifici.

I miRNA ed i siRNA agiscono nelle vie di silenziamento post-trascrizionale dell’RNA:

1- Un siRNA deriva dal prodotto a doppio filamento di un virus o di un elemento trasponibile o da un dsRNA sintetico fornito da un ricercatore ed è diretto contro gli stessi trascritti da cui ha avuto origine

2- Un miRNA è codificato da un segmento convenzionale del genoma ed è diretto contro uno specifico mRNA come parte di un normale programma cellulare

- siRNA servono principalmente per mantenere l’integrità del genoma

- miRNA servono principalmente per regolare l’espressione genica

I miRNA sono sintetizzati dalla RNA polimerasi II. Il trascritto si ripiega su se stesso a formare un lungo RNA a forcina (pri-miRNA)

1. Il pri-miRNA viene tagliato da Drosha (un enzima) e forma un precursore più corto ripiegato su se stesso a forcina (pre-miRNA)

2. Il pre-miRNA è esportato nel citoplasma, dove è tagliato da Dicer in un piccolo miRNA

3. Il miRNA viene associato ad una proteina Argonauta (Ago1) e il complesso pre-RISC: separazione dei filamenti e rimozione del filamento passeggero.

4. miRNA è parzialmente complementare ad una regione nel 3’UTR dell’mRNA bersaglio: si forma una piccola ansa

5. Il legame del miRNA con l’mRNA porta:

all’inibizione della traduzione dell’mRNA
o alla sua destabilizzazione e degradazione.

I miRNA possono essere secreti dalle cellule e funzionano da mediatori della comunicazione inter-cellulare.

IncRNA

lncRNA, o RNA lungo non codificante, è una classe di RNA che non viene tradotta in proteine, ma svolge ruoli importanti nella regolazione dell'espressione genica e in vari processi cellulari. Le funzioni dei IncRNA sono:

Regolazione della struttura della cromatina, regolazione epigenetica
Regolazione trascrizione genica
Regolazione splicing
Regolazione della traduzione di mRNA

RNA interagenti con piwi (piRNA)

RNA a singolo filamento interagiscono e guidano proteine della famiglia PIWI.

Inizialmente scoperti come meccanismo di difesa contro i trasposoni.

I trasposoni sono elementi genetici mobili.

Quando gli elementi trasponibili si spostano, si inseriscono a caso nel DNA bersaglio. Possono quindi inserirsi nel centro di un gene che codifica per una proteina, inibendone l’espressione/funzione.

La formazione dei piRNA non coinvolge la formazione di dsRNA precursori e il taglio da parte di Dicer. Essi subiscono un processo di maturazione e vengono trasportati nel citoplasma.

Funzioni dei piRNA:

sviluppo embrionale e mantenimento dell'integrità del DNA germinale,
silenziamento della trascrizione del trasposone,
formazione di eterocromatina
regolazione epigenetica della determinazione del sesso.

Meccanismi di controllo dell’espressione genica

I diversi tipi cellulari di un organismo pluricellulare contengono lo stesso DNA ma attivano l’espressione di geni diversi, diversificandosi.

Le cellule modificano l’espressione dei geni in risposta a segnali esterni.

Esistono molteplici livelli di regolazione dell’espressione genica:

1) Controllo trascrizionale; 2) controllo delle modificazioni dell’RNA; 3) controllo del trasporto e localizzazione dell’RNA; 4) controllo traduzionale; 5) controllo della stabilità e degradazione dell’RNA; 6) controllo dell’attività delle proteine (modificazioni post-traduzionali, localizzazione, degradazione delle proteine)

Ciclo cellulare

Tutte queste cellule diverse derivano da un’unica cellula, lo zigote o cellula uovo fecondata.

Lo ZIGOTE si sviluppa in organismo mediante 2 processi:

1) DIVISIONE CELLULARE o CICLO CELLULARE

2) DIFFERENZIAMENTO CELLULARE.

Il ciclo cellulare è quella serie di eventi coordinati che si ripetono in maniera ciclica e portano alla riproduzione di una cellula.

La divisione cellulare nei batteri

Nei batteri la divisione cellulare avviene per scissione binaria: la cellula cresce di dimensioni, duplica il proprio DNA e poi si divide, producendo due cellule identiche.

La scissione binaria si compone di 4 eventi:

1: La replicazione del DNA che inizia in un singolo sito del DNA (origine di replicazione).

2: La replicazione del DNA che prosegue in entrambe direzioni.

3: L’elongazione della cellula e la segregazione dei due DNA. Formazione di una nuova parete cellulare

4: La citochinesi o divisione del citoplasma che termina quando le due cellule si sono separate.

La divisione cellulare negli eucarioti

Il ciclo cellulare consiste di due fasi principali:

INTERFASE (G0): comprende le fasi G1, S e G2. La cellula trascorre la maggior parte del suo tempo in interfase ed in questo periodo NON avviene divisione cellulare.
FASE M (MITOSI E CITOCHINESI): MITOSI o divisione nucleare (che produce 2 nuclei IDENTICI a quello della cellula madre); CITOCHINESI o divisione del citoplasma per formare 2 cellule figlie identiche.

Interfase

G0 = Durante questa fase, le cellule svolgono il loro «lavoro» fino a quando ricevono un segnale di «riproduzione» che le fanno tornare in fase G1.

G1 = È l’intervallo di tempo tra la mitosi e replicazione del DNA (S). La crescita ed il normale metabolismo della cellula (sintesi di tRNA, mRNA, ribosomi e proteine) avvengono in fase G1, la più lunga. Inoltre, la cellula duplica i suoi organelli. È la fase in cui le cellule si integrano con l’ambiente esterno e «prendono la decisione» di proliferare o di entrare in quiescenza (G0). Verso la fine della fase G1, la cellula incrementa l’attività degli enzimi richiesti per la sintesi del DNA. La cellula ha solo una copia dei suoi cromosomi in fase G1.

G1 cromatina condensata = La trascrizione ha luogo, quindi il DNA è in una conformazione rilassata (uncoiled). Le modificazioni post-traduzionali delle code degli istoni partecipano non solo alla regolazione della trascrizione, ma anche al processo di divisione cellulare.

S (sintesi) = Durante la fase S avvengono 3 eventi: replicazione del DNA; sintesi degli istoni; sintesi dei centromeri. I due cromatidi fratelli che derivano dalla replicazione del DNA saranno uniti mediante i centromeri. Il centromero è la regione del cromosoma in cui i cromatidi sono a stretto contatto. È costituito da DNA altamente ripetuto rappresentato da una serie di ripetizioni in tandem di DNA alfa satellite quindi fortemente eterocromatico. Vengono duplicati i centrioli.

G2 = È l’intervallo di tempo tra la replicazione del DNA (Fase S) e la mitosi. È la fase più corta del ciclo cellulare. Durante questo intervallo, si verifica un aumento della sintesi proteica, come stadio terminale della preparazione della cellula alla divisione e la cellula duplica i centrioli.

Microtubuli e centrioli

Il CENTRO DI ORGANIZZAZIONE DEI MICROTUBULI (MTOC), o centrosoma risulta dall’associazione di due cilindretti cavi disposti in maniera perpendicolare detti centrioli.

I centrioli sono strutture costituite da 9 triplette di microtubuli localizzati nel centrosoma.

I centrioli si trovano in coppia e sono circondati da un materiale elettrondenso detto "materiale o matrice pericentriolare" (PCM).

Si distinguono un centriolo più anziano madre, vecchio di almeno due cicli cellulari, e uno figlio, che risale almeno al ciclo cellulare precedente.

Fase M

La fase M è composta da diverse fasi:

mitosi, che a sua volta si divide in:
profase
prometafase
metafase
anafase
telofase
citochinesi (divisione del DNA)

Mitosi: Profase e compattazione dei cromosomi

La profase inizia con la compattazione dei cromosomi: i lunghi filamenti di cromatina iniziano un processo di spiralizzazione che li rende più corti e più spessi.

Ogni cromosoma è stato duplicato nella fase S e consiste di una COPPIA di CROMATIDI FRATELLI (cromosoma DICROMATIDICO).

I cromatidi contengono una regione centrale detta CENTROMERO e si associano mediante i loro centromeri.

L’associazione dei cromatidi è mediata dalle proteine COESINA, che si estendono per tutta la loro lunghezza e formano un anello in corrispondenza dei centromeri.

Il centromero è essenziale per la corretta segregazione dei cromatidi durante l'anafase mitotica e meiotica. Durante la divisione cellulare le sequenze centromeriche si associano a proteine specifiche che formano un complesso multiproteico chiamato cinetocore capace di legare i microtubuli del fuso responsabili della segregazione.

I microtubuli sono fondamentali per il processo che permette la separazione dei cromatidi fratelli, ciascuno dei quali migrerà in una delle due cellule figlie.

Profase: cinetocore e fuso mitotico

La cellula in divisione appare come una SFERA con un equatore e due poli opposti (centrioli).

I microtubuli si irradiano da ciascun polo e formano il FUSO MITOTICO. L’estremità meno dei microtubuli si trova ai poli dei fusi.

Prometafase: disgregazione dell’involucro nucleare

L’involucro nucleare si frammenta ed i microtubuli del fuso vengono in contatto con i cromosomi.

I frammenti dell’involucro nucleare vengono sequestrati all’interno di vescicole, per poi essere riutilizzati quando l’involucro nucleare delle due cellule figlie dovrà essere ricomposto.

La membrana nucleare è contigua e continua con la membrana del reticolo endoplasmatico (RE): essa contiene proteine integrali che connettono la membrana dell’involucro alle lamine nucleari ed alla cromatina.

La membrana nucleare si disgrega e sue porzioni fondono progressivamente con la membrana del reticolo endoplasmatico (ER): le proteine integrali che erano presenti nell’involucro nucleare si trovano nella membrana del RE durante la mitosi.

Inizialmente i cromosomi duplicati sono sparsi per tutta la regione nucleare.

I microtubuli si allungano e si accorciano in direzione del centro della cellula; quando incontrano un centrosoma vi si legano saldamente.

I microtubuli del fuso che provengono dai due lati opposti della cellula si attaccano ai cinetocori di ciascun cromatidio fratello di ogni cromosoma. I cromosomi cominciano a spostarsi verso il piano equatoriale della cellula.

Da prometafase a Metafase: le coesine

I cromatidi fratelli duplicati sono uniti dalle proteine COESINE.

Le coesine sono particolarmente concentrate a livello del cinetocore.

Al termine della profase, le coesine si staccano dai bracci dei cromatidi fratelli, liberandoli l’uno dall’altro.

All’inizo della prometafase, tutti i cromosomi della cellula si allineano lungo il piano equatoriale o PIASTRA METAFASICA.

Durante la metafase, ogni cromatidio è totalmente condensato ed appare ben distinguibile dagli altri.

È in questa fase del ciclo che viene studiato il cariotipo, ovvero la composizione cromosomica per valutare la presenza di anomalie.

Metafase: dissociazione delle coesine

Al termine della metafase, le coesine che erano rimaste a livello del cinetocore si dissociano.

I cromatidi fratelli non sono più attaccati alle loro copie e vengono considerati come cromosomi figli.

I cromosomi figli disgiunti migrano ai poli opposti utilizzando i microtubuli del fuso.

Anafase

I cinetocori sono ancora attaccati ai microtubuli dei cinetocori.

I cinetocori trasportano i cromosomi verso i poli opposti.

L’anafase termina quando tutti i cromosomi hanno raggiunto i poli.

La depolimerizzazione dei microtubuli a livello del cinetocore contribuisce al suo spostamento (quindi anche a quello dei cromosomi) durante l’anafase.

Telofase: formazione di due nuclei

I cromosomi arrivati ai poli si decondensano despiralizzandosi.

Attorno ad ogni serie di cromosomi, si sviluppa un involucro nucleare costituito in parte da piccole vescicole e da altri componenti che derivano dal vecchio involucro nucleare.

I microtubuli del fuso scompaiono.

Centrioli e microtubuli

Una coppia di centrioli è immersa nel centro organizzatore dei microtubuli (MTOC).

Questi sono circondati dalla sostanza pericentriolare.

Durante la fase S dell’interfase, ciascun centriolo si duplica, dando origine a 2 coppie di centrioli. Anche la sostanza pericentriolare viene duplicata. I microtubuli del fuso terminano nella sostanza pericentriolare ma NON sono in contatto con i centrioli.

Durante la tarda profase, i microtubuli si irraggiano a partire dalla sostanza pericentriolare, generando dei fasci detti ASTER (microtubuli astrali).

Gli ASTER si muovono verso i due lati opposti del nucleo, generando i due poli del fuso mitotico.

Il fuso mitotico

Il fuso mitotico è formato da 3 tipi di microtubuli:

1) microtubuli polari (non dei cinetocori), che si estendono dai poli alla regione equatoriale e interagiscono con i microtubuli polari del polo opposto.

2) microtubuli dei cinetocori, che si estendono dai poli e si attaccano ai cromosomi a livello dei loro cinetocori.

3) microtubuli dell’aster, sono corti che formano l’aster attorno a ciascun polo.

Citocinesi o citodieresi

La citocinesi è la divisione del citoplasma per produrre due cellule figlie.

Comincia nel momento in cui un anello contratille di acto-miosina si forma e viene associato alla membrana plasmatica. La contrazione dell’anello produce un solco di divisione fino alla separazione delle due cellule. La mancanza di citocinesi provoca la formazione di cellule multinucleate.

Le molecole di miosina (con attività motrice) fanno muovere i filamenti di actina, causando la costrizione dell’anello.

Per definizione si parla di divisione di una cellula madre in due cellule figlie identiche; in realtà le due cellule che originano sono diverse (divisione cellulare asimmetrica) per: contenuto proteico, dimensione cellulare e potenziale di sviluppo.

Controllo del ciclo cellulare

Il ciclo cellulare comprende centinaia di eventi sequenziali che procedono in modo ordinato; errori nella successione di questi eventi possono avere conseguenze drammatiche.

Esistono quindi dei punti di controllo del ciclo cellulare ed un sistema di controllo del ciclo cellulare.

Il punto di controllo G1-S garantisce che la cellula abbia i fattori di crescita, nutrienti ed enzimi necessari per sintetizzare il DNA. In assenza dei segnali corretti che indicano che la cellula è pronta a procedere, il punto di controllo non consente l’inizio della sintesi del DNA.
Punto di controllo G2-M garantisce che la replicazione del DNA sia terminata prima dell’inizio della mitosi. Se una cellula ha del DNA danneggiato o non completamente replicato, il punto di controllo non le consente di entrare in mitosi.
Punto di controllo metafase-anafase (detto anche punto di controllo del fuso). Si trova alla fine della metafase ed impedisce l’inizio dell’anafase fintanto che i cinetocori non sono tutti correttamente attaccati ai microtubuli del fuso mitotico a livello del piano equatoriale della cellula.

Le molecole chiave del controllo del ciclo sono protein-chinasi ciclina-dipendenti (Cdk), enzimi che attivano o inattivano altre proteine mediante fosforilazione.

Le Cdk si legano a specifiche cicline (di tipo A, B, D, E) ed il complesso ciclina-Cdk fosforila proteine target. Ci sono 4 complessi ciclina-Cdk:

- G1-Cdk che prepare la cellula a passare dalla fase G1 alla fase S;

- G1/S-Cdk che prepara la cellula alla replicazione del DNA;

- S-Cdk avvia la replicazione;

- M-Cdk promuove gli eventi della mitosi e attiva il compesso che promuove l’anafase (APC), che è responsabile dell’inizio del’anafase.

La concentrazione delle cicline varia nelle diverse fasi del ciclo cellulare, attivando le diverse CdK.

La replicazione del DNA

La replicazione del DNA è un processo fondamentale attraverso il quale una cellula copia il suo DNA prima della divisione cellulare. Questo processo garantisce che ogni cellula figlia riceva una copia identica del materiale genetico. La replicazione del DNA avviene in diverse fasi e coinvolge vari enzimi e proteine. Ecco una panoramica delle fasi principali:

Inizio della replicazione: La replicazione inizia in specifiche regioni del DNA chiamate origini di replicazione. Qui, la doppia elica del DNA viene aperta grazie all'azione di enzimi chiamati DNA elicasi, creando una "forchetta di replicazione".
Stabilizzazione dei filamenti: Una volta che i filamenti di DNA sono separati, le proteine leganti il DNA a filamento singolo (SSB) si legano ai filamenti singoli per stabilizzarli e prevenire che si riassocino.
Sintesi dei nuovi filamenti: La DNA polimerasi è l'enzima principale che sintetizza nuovi filamenti di DNA. Essa aggiunge nucleotidi complementari ai filamenti originali (può aggiungere nucleotidi solo al terminale 3’ di una catena pre-esistente). Affinchè la sintesi di DNA inizi, al punto di origine viene sintetizzato un RNA di 5-14 nucleotidi detto RNA primer (sintetizzato dalla DNA primasi). La sintesi avviene in direzione 5' verso 3', il che significa che il filamento leader viene sintetizzato in modo continuo, mentre il filamento lagging viene sintetizzato in segmenti chiamati frammenti di Okazaki.
Unione dei frammenti: I frammenti di Okazaki sul filamento lagging vengono uniti dalla DNA ligasi, che crea un filamento continuo.
Terminazione: Una volta che la replicazione è completata, si ottengono due molecole di DNA identiche, ciascuna composta da un filamento originale e uno nuovo (replicazione semiconservativa).

La replicazione del DNA coinvolge una serie di proteine ed enzimi che lavorano in sinergia per garantire che il processo avvenga in modo preciso e efficiente. Ecco alcune delle principali proteine coinvolte nella replicazione del DNA:

DNA elicasi: Questo enzima separa i due filamenti di DNA, rompendo i legami idrogeno tra le basi azotate e creando una "forchetta di replicazione".
Proteine leganti il DNA a filamento singolo (SSB): Queste proteine si legano ai filamenti di DNA a singolo filamento per stabilizzarli e prevenire la loro riassociazione o formazione di strutture secondarie.
DNA polimerasi: Lega le subunità nucleotidiche tra di loro per formare un nuovo filamento di DNA a partire da un filamento di DNA stampo. La DNA polimerasi possiede la caratteristica di enzima correttore di bozze. La DNA polimerasi non può iniziare la sintesi di un nuovo filamento senza un primer. Essa può aggiungere nucleotidi solo al terminale 3’ di una catena pre-esistente.
DNA primasi: Questo enzima sintetizza un breve frammento di RNA chiamato primer, che fornisce un punto di inizio per la DNA polimerasi.
DNA ligasi: Questo enzima unisce i frammenti di Okazaki sul filamento lagging, creando un filamento continuo di DNA.
Topoisomerasi: taglia uno o entrambi i filamenti di DNA evitando l’eccessivo avvolgimento durante la replicazione e li ricuce in una configurazione più rilassata.
Proteine di inizio: Queste proteine riconoscono le origini di replicazione e aiutano a reclutare gli enzimi necessari per avviare il processo di replicazione.

La sintesi del DNA avviene in modo discontinuo su un filamento e continuo sull’altro filamento. Dopo che l’elica di DNA viene aperta, abbiamo che:

Filamento continuo/guida: Durante la replicazione del DNA, il filamento leader (o filamento continuo) viene sintetizzato in modo continuo nella direzione della forcella di replicazione. Questo filamento è sintetizzato in un'unica sequenza continua grazie all'azione dell'enzima DNA polimerasi, che aggiunge nucleotidi in modo costante mentre si sposta lungo il filamento stampo.
Filamento discontinuo/in ritardo: Il filamento lagging (o filamento discontinuo) viene sintetizzato in segmenti, noti come frammenti di Okazaki. Questi frammenti sono creati perché la DNA polimerasi può aggiungere nucleotidi solo in direzione 5' a 3'. Pertanto, mentre la forcella di replicazione si apre, il filamento lagging deve essere sintetizzato in modo discontinuo, creando questi brevi segmenti che vengono successivamente uniti insieme dall'enzima ligasi.

Quando il frammento di Okazaki neosintetizzato raggiunge quello sintetizzato appena prima, il suo RNA primer viene degradato dalla RNAsi H, che riconosce e degrada in modo specifico ibridi di RNA: DNA.

Ci sono tre modelli della replicazione del DNA, che sono:

Modello semiconservativo = i due filamenti del DNA originale si separano e servono ciascuno come stampo per generare un nuovo filamento. Il DNA finale è costituito da un filamento originale stampo e dall’altro che ne è la copia.
Modello conservativo = il DNA a doppia elica originale serve come stampo per generare quello nuovo. I due filamenti originali si riuniscono, così come i due filamenti figli.
Modello dispersivo = il DNA si spezza in frammenti che vengono replicati e riuniti.

Le coppie di nucleotidi si appaiano in modo complementare; quindi ciascun filamento di DNA serve da stampo per la sintesi del filamento opposto.

I legami a idrogeno si rompono ed entrambi i filamenti vengono ricopiati. Questo sistema di ricopiatura è detto: replicazione semiconservativa.

Ne deriva che ciascuna nuova molecola di DNA è costituita da un filamento parentale ed uno neosintetizzato.

Invece appaiamenti errati di basi dovuti a piccoli spostamenti nello spazio delle basi sarebbero molto più frequenti: wobble.

Deaminazione: mutazione spontanea che porta alla conversione di citosina in uracile; conversione di base.

Lo scivolamento del filamento durante la replicazione del DNA
Quando si verifica uno slittamento del filamento durante la replicazione del DNA, un filamento di DNA può andare in loop, causando l'aggiunta o la delezione di un nucleotide sul filamento appena sintetizzato.

La replicazione semiconservativa spiega la trasmissione delle mutazioni, poiché a causa di un errore nella duplicazione si ha una sostituzione di qualche base nucleotidica. La sequenza mutata viene copiata e tramandata alle molecole figlie.

Le DNA polimerasi commettono molti errori durante la replicazione, e un accumulo di questi errori può causare il cancro. Per fortuna, esistono sistemi enzimatici di riparazione che riparano le mutazioni. Le mutazioni, però, non sono sempre negative.

Riparazione degli errori nel DNA

Anche se l’appaiamento delle basi del DNA è molto efficiente, si possono verificare degli errori.

La DNA polimerasi possiede attività esonucleasica: correttore di bozze.

Le DNA polimerasi verificano che l’appaiamento di basi sia corretto.

Quando trova un errore, la DNA polimerasi rimuove il nucleotide sbagliato e lo sostituisce con quello giusto: mismatch repair.

Riparazione per escissione nucleotidica

Serve per riparare lesioni nel DNA danneggiato da radiazioni UV del sole o sostanze chimiche. Ci sono diversi attori:

DNA nucleasi (che taglia il frammento danneggiato)
DNA polimerasi (che lo risintetizza)
DNA ligasi (che li unisce) cooperano per riparare questo tipo di danno.

Cromatina e cromosomi

Nella cromatina estesa le fibre formano anse a spirale tenute insieme dalle proteine di impalcatura.

Le anse interagiscono a formare la cromatina condensata. Le proteine condensine poi compattano la cromatina in cromosomi.

Quando l’istone H1 si lega al DNA di giunzione (DNA linker), i nucleosomi adiacenti vengono impacchettati a formare una fibra.

I telomeri

I telomeri sono brevi sequenze ricche in guanina ripetute molte volte, essi incappucciano le estremità dei cromosomi eucariotici.

I cromosomi hanno cappucci terminali o TELOMERI che NON contengono geni che codificano per proteine.

La rimozione del primer di RNA al 5’ produce molecole di DNA con estremità più corte rispetto al DNA di partenza, poiché è impossibile innescare la sintesi dell’ultimo segmento 5’.

Ad ogni divisione cellulare si ha la progressiva perdita di un pezzettino di DNA dai telomeri.

Una cellula può dividersi molte volte prima di cominciare a perdere informazione genetica essenziale. La progressiva perdita di DNA dai telomeri contribuirebbe all’invecchiamento.

Esistono enzimi detti telomerasi che sintetizzano sequenze nucleotidiche alle estremità dei cromosomi e li allungano.

Le telomerasi sono presenti nelle cellule che possono dividersi un numero illimitato di volte, come protozoi, organismi eucarioti unicellulari e cellule cancerose.

Inoltre, sono presenti nelle cellule della linea germinale (da cui originano le cellule uovo e gli spermatozoi), nelle cellule che si dividono rapidamente (cellule del sangue, della pelle, del rivestimento dell’intestino), ma non nella maggior parte delle cellule somatiche dell’adulto.

La capacità delle cellule di riparare in modo efficiente danni al DNA sarebbe uno dei meccanismi che permetterebbe ad alcune specie animali di vivere a lungo in buono stato di salute e di presentare una bassa tendenza a sviluppare tumori (le cellule cancerose sono caratterizzate da instabilità genomica).

La morte cellulare

Il numero di cellule necessarie alla formazione di un tessuto è strettamente determinato.

Il numero di cellule è mantenuto costante attraverso un equilibrio tra divisione (proliferazione) e morte cellulare al fine di garantire l’omeostasi tissutale.

La morte cellulare può manifestarsi in due modalità:

Necrosi: processo passivo che avviene quando una cellula subisce un insulto. La sua membrana si rompe e il suo contenuto viene riversato nello spazio extracellulare innescando una risposta infiammatoria. La necrosi è una morte cellulare non controllata.
Apoptosi: processo attivo che risulta da un preciso programma genetico che determina la morte (suicidio) della cellula. Quindi, l’apoptosi è una morte cellulare programmata.

Apoptosi

Durante l’apoptosi si osserva una sequenza precisa di eventi:

la cellule espelle acqua
Il DNA viene condensato e frammentato.
Il nucleo si rompe.
Il plasmalemma presenta invaginazioni (blebbing).
Il processo di blebbing forma i corpi apoptotici che vengono poi fagocitati dalle cellule adiacenti.

Durante l’apoptosi la membrana viene preservata per evitare la fuoriuscita del contenuto cellulare.

Non c’è risposta infiammatoria.

L’apoptosi garantisce la specificità del tessuto: una cellula che non appartiene a un tessuto non potrà crescere e sopravvivere perche non riceverà o non sarà in grado di interpretare i segnali di sopravvivenza locali.

L’apoptosi è un strumento importante di un programma differenziativo-morfogenetico durante lo sviluppo.

Tappe del processo di fagocitosi di corpi apoptotici

La fagocitosi di corpi apoptotici è un processo fondamentale attraverso il quale le cellule del sistema immunitario, come i macrofagi, riconoscono e rimuovono le cellule morte o danneggiate. Ecco le tappe principali di questo processo:

Riconoscimento:

Le cellule apoptotiche espongono segnali di "non sopravvivenza" sulla loro superficie, come la fosfatidilserina. Questi segnali sono riconosciuti dai recettori sui fagociti.
I fagociti possono anche utilizzare proteine di riconoscimento, come le opsonine, che legano i corpi apoptotici e facilitano l'interazione con i fagociti.

Adesione:

Una volta riconosciuti, i fagociti si legano ai corpi apoptotici attraverso interazioni tra recettori e ligandi, stabilizzando l'adesione.

Ingestione:

Il fagocita estende le sue membrane cellulari attorno al corpo apoptotico, formando una vescicola chiamata fagosoma.
Questo processo può coinvolgere la riorganizzazione del citoscheletro del fagocita, in particolare i filamenti di actina, per facilitare l'invaginazione della membrana.

Fusione con i Lisosomi:

Il fagosoma si fonde con i lisosomi, formando un fagolisosoma. I lisosomi contengono enzimi digestivi che degradano il materiale interno.

Degradazione:

Gli enzimi lisosomali degradano i componenti cellulari dei corpi apoptotici, permettendo al fagocita di riciclare i materiali utili e di eliminare i rifiuti cellulari.

Espulsione dei Rifiuti:

Dopo la degradazione, i residui non digeribili possono essere espulsi dal fagocita attraverso l'esocitosi, completando così il processo di fagocitosi.

Risposta Immunitaria:

La fagocitosi dei corpi apoptotici può anche attivare segnali che modulano la risposta immunitaria, contribuendo a mantenere l'omeostasi e prevenire reazioni infiammatorie eccessive.

Nel processo apoptotico ci sono diversi attori, che sono: caspasi, proteine adattatrici, fattori e recettori TNF e TNFR e proteine della famiglia BCL2.

Caspasi

La caspasi è molecola chiave per avviare l’apopotosi. Essa è un pro-enzima inattivato che viene attivato tramite un segnale pro-apoptotico.

Sono classificate in:

caspasi iniziatrici = tagliano le pre-forme inattive delle caspasi effettrici. Esse monomeri che dimerizzano e vengono clivate dopo attivazione da un segnale esterno;
caspasi effettrici = esistono come dimeri e vengono clivate dalle caspasi iniziatrici attive

Le caspasi, oltre ad indurre l’apoptosi, hanno anche funzioni non-apoptotiche e partecipano in complessi processi quali l’infiammazione e il differenziamento cellulare.

I segnali che attivano le caspasi sono:

via estrinseca o recettoriale = attivazione di un recettore TNF sulla membrana plasmatica ad opera del ligando FAS;
via intrinseca o mitocondriale = rilascio di componenti MITOCONDRIALI nel citoplasma con liberazione del citocromo c ed attivazione della proteasi APAF-1
danno del DNA

I mitocondri ed il rilascio di citocromo c

1) Il citocromo c è legato alla membrana interna dei mitocrondri mediante interazioni idrofobiche ed elettrostatiche con la cardiolipina, un fosfolipide mitocondriale.

2) Specie reattive dell’O2 prodotte durante le fasi iniziali dell’apoptosi portano all’ossidazione della cardiolipina.

3) Il citocromo c è rilasciato con conseguente attivazione della cascata apoptotica.

4) Vengono anche rilasciate altre proteine pro-apoptotiche

Il citocromo c è coinvolto nel trasporto degli elettroni nella catena respiratoria dei mitocondri.

Apoptosoma = complesso multiproteico formato dal citocromo c, APAF-1 (apoptotic peptidase activating factor 1) e procaspasi 9 (caspasi iniziatrice)

Danno del DNA

Esso è dovuto sopratutto a mutazioni con attivazione del fattore di trascrizione p53.

I mitocondri rilasciano il citocromo c, che induce la formazione dell’apoptosoma e l’attivazione della caspasi 9.

p53 è un fattore di trascrizione che regola l’espressione di geni pro-apoptotici ed anti-

apoptotici. Funzioni di p53:

1) Repressione di geni che inibiscono la morte cellulare (Bcl-2 etc.)

2) Induzione di geni che promuovono apoptosi per via intrinseca ed estrinseca

3) Induce la rilocalizzazione in membrana dei recettori di morte (Fas)

4) Fra i geni indotti vi è anche quello codificante per Mdm2 (Murine double minute 2) che lega p53 e ne induce la degradazione mediata dal proteasoma, che avviene nel citoplasma.

Mdm2 agisce come regolatore negativo di p53.

L’apoptosi come meccanismo cellulare per combattere il cancro e l’invecchiamento (p53)

La proteina p53 (gene TP53) svolge importanti funzioni nel regolare:

la proliferazione cellulare
il differenziamento cellulare: p53 agisce a livello del differenziamento dineuroni, cellule muscolari, adipociti, cellule ematopoietiche, osteoblasti etc.
il normale sviluppo cellulare

p53 ha un ruolo chiave nel regolare il ciclo cellulare e l'induzione dell'apoptosi.

In presenza di cellule staminali aberranti, p53 contribuisce ad indurne l'eliminazione mediante apoptosi al fine di evitare la progressione di queste cellule staminali aberranti in cellule tumorali.

Infatti, recenti studi indicano che le cellule staminali «aberranti» sarebbero all'origine della formazione dei tumori.

Stress del reticolo endoplasmatico e risposta a proteine malripiegate (UPR)

Numerosi fattori possono causare lo stress del reticolo endoplasmico, il quale a sua volta innesca la risposta a proteine malripiegate (UPR).

Questi fattori includono:

espressione di proteine mutate che hanno conformazioni scorrette
alterazioni dell’equilibrio ossido-riduttivo delle cellule
sintesi e secrezione di proteine ad alti livelli

Attivazione di IRE1 alpha: DIMERIZZAZIONE AUTOFOSFORILAZIONE

La forma fosforilata ha attività di RNAse, quindi processa l’mRNA che codifica per

XPB1u (unspliced X box-binding proteins 1)

L’mRNA per XBP1 produce XPB1, un fattore di trascrizione che induce l’espressione di specifici geni target.

La kinasi PERK fosforila eIF2 alpha (fattore di inizio della traduzione).

eIF2alpha fosforilato inibisce la traduzione ed induce la formazione di granuli da stress (complessi ribonucleoproteici nei quali gli mRNA vengono mantenuti silenti temporaneamente).

Vengono però tradotti fattori specifici richiesti per la risposta allo stress, come ATF4.

ATF4 è un fattore di trascrizione che trasloca nel nucleo dove induce l’espressione di geni coinvolti in autofagia, apoptosi e risposta antiossidante.

ATF6 è un fattore di trascrizione normalmente localizzato nell’ER.

In seguito a stress è trasportato nel Golgi e viene processato per generare un frammento attivo citosolico (ATF6f).

ATF6f penetra nel nucleo dove induce l’espressione di geni coinvolti nel processo ERAD (ER-associated-degradation) e XBP1.

Se non regolato, lo stress può indurre apoptosi come segue:

la cellula attuerà meccanismi per rispondere alla situazione di stress, adattarsi e poi ripristinare il suo equilibrio/omeostasi
se lo stress è prolungato ed eccessivo, la cellula attiverà la risposta di morte programmata o apoptosi